Os autores gostariam de agradecer ao laboratório do Dr. Carol Kim para a formação microinjeção, Clarissa Henry para o conselho, que visa acelerar o desenvolvimento do embrião e utilização de equipamentos, e Nathan Lawson para contribuir fli1: peixe EGFP. Agradecemos os membros do laboratório Wheeler e Shawn Paredes para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos também de agradecer a Mark Nilan para cuidado dos peixes e conselhos, e Ryan Phennicie e Kristin Gabor para consultoria técnica sobre este projeto. Este trabalho foi financiado por um estágio de pesquisa para MAFES K. Brothers, um MAFES escotilha concessão E08913-08, e um prêmio NIH NCRR P20RR016463 a R. Wheeler.

Todos os protocolos de atendimento zebrafish e experimentos foram realizados sob Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) protocolo A2009-11-01. 1. Morfolino e Pratos de injeção larval Duração Experimental: * (10-15 minutos) Grau de dificuldade: * <ol><li> Para injecções de ovo, preparar uma solução a 2% de agarose em água estéril e microondas. Quando a solução tiver arrefecido colocar um pouco dele em uma placa de Petri extra profundo (Fisher Scientific) até que ele está meio cheio. Esfriar em gelo e verifique se a placa está nivelado. </li><li> Uma vez que o prato ter arrefecido, verter uma camada de topo 15 mL de agarose a 2%. Borrife uma injeção ovo sulcado de moldes de plástico (Ferramentas Adaptive Ciência) com água estéril de um frasco de spray. Com cuidado, coloque o lado da ranhura do molde para baixo na agarose quente. Quando a agarose foi arrefecida, utilizar uma espátula de metal plana (VWR Scientific) para dissociar o molde da agalevantou-se. Lentamente remover a grade a partir da agarose. Pratos envoltório de embriões de injecção em Parafilm (VWR Scientific) e armazenar invertido a 4 ° C. </li><li> Para injecções de larvas de peixe, preparar uma solução a 2% de agarose como descrito. Despeje a solução no prato um padrão de tamanho Petri (VWR Scientific) e reserve até que ela se solidifica. Quebrar pratos de injeção de larvas em Parafilm e loja invertido a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparação Cultura fúngica Duração Experimental: ** (30 minutos) Grau de dificuldade: ** <ol><li> Preparar extracto de levedura-peptona-dextrose (YPD) placas de ágar: 10 g / litro de extracto de levedura, 20 g / litro de peptona, 20 g de dextrose / litro, e 20 g de agar / litro para dentro e para autoclave. Para preparar o líquido YPD 10 g / litro de extracto de levedura, 20 g / litro de peptona, 20 g de dextrose / litro e de autoclave de 20-30 minutos a 121 ° C. </li><li> Dois dias antes de infecções preparar um prato de peixe raia de congeladosexistências de culturas de Candida albicans em agar YPD para obter colónias individuais. </li><li> Incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Coloque 5 mL de caldo YPD em 16 x 150 mm tubos de cultura (VWR Scientific). </li><li> Um dia antes de as infecções de peixe pegar um pequena colônia no ágar YPD com um passador de madeira (VWR Scientific). Coloque o pau no tubo de cultura e giram em volta para re-suspender colônia no líquido YPD. </li><li> Crescer durante a noite a 37 ° C em um tambor TC-7 Tissue Culture rolo equipado com uma roda de tubo de 14 polegadas de teste (New Brunswick Scientific). </li><li> No dia seguinte, girar para baixo 1 mL de cultura no g 14000x durante 1 minuto num tubo mL 1,7 (Axygen). Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em líquido residual por vórtice (VWR Scientific). </li><li> Adicionar 1 mL 1x tampão fosfato salino (VWR Scientific) e girar como descrito anteriormente. </li><li> Repita a lavagem PBS 3 vezes. </li><li> Diluir diluição 1:100 em PBS 1x (10 uL de lavado C. albicans em 990 uL 1x PBS). </li><li> Conte com um hemocitômetro (VWR Scientific). </li><li> Diluir a 10 7 células / mL. </li></ol> 3. Infecções zebrafish Duração Experimental: **** (1-3 horas) Grau de dificuldade: **** <ol><li> Recolher embriões de acordo com a seção 5 e loja no ovo de água, 60 mg / l sal dos oceanos instantâneas (Fisher Scientific) em água deionizada estéril. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, tais como o SZ61 Olympus (Olympus), embriões dechorionate no dia da infecção. Use Dumont Dumoxel pinças (VWR Scientific) para puxar o córion 27 pedaços como abrir um saco de batatas fritas, ou picar delicadamente a pinça na posição fechada dentro do córion e então lentamente abri-los. O peixe deve aparecer para a direita fora do córion. </li><li> Agitar o prato de Petri extra profundo com a tampa sobre a mover peixe para o centro do prato. Transfira o peixe para a tampa do prato. Remover ovo de água esubstituir por meio fresco. Adicione o peixe para a mídia. </li><li> Quentes larvas pratos de injeção em uma incubadora a 28 ° C. Preparar metano sulfonato tricaina (Western Chemical Inc.) de diluição a 200 ug / mL para anestesiar peixe. </li><li> Contar o número desejado de larvas para a infecção (20-50 de peixe). Coloque o peixe em tricaina solução metano sulfonato e esperar 1-2 minutos até que eles param de se mover. </li><li> Ligue a unidade MPPI-3 de injeção (Applied Scientific Instruments). Verifique se o interruptor de pressão está no &quot;pulso&quot; e &quot;duração de impulso&quot; é definido como 9 com 3 PSI para a unidade de contrapressão. Abrir a válvula para o tanque de azoto até que a pressão sobre a unidade de injecção lê 30 PSI. </li><li> Carregar uma micropipeta puxado 28 com 5 uL de vórtex Cândida albicans a uma concentração de 1x10 7 células / mL. Coloque a micropipeta no suporte micropipeta (Applied Scientific Instruments). Encha uma placa de Petri vazia extra profundo com água. Mova o micropipeta até a ponta is dentro de vista apenas tocar a superfície da água através de microscópio de dissecção e utilização Dumont Dumoxel pinça (VWR Scientific) para cortar a agulha cerca de 3 mm a partir da ponta da pipeta puxado. </li><li> Pressione o pedal (Applied Scientific Instruments) para verificar a agulha foi cortada. Você deverá ver o líquido disperso se você fosse bem sucedido. O diâmetro do bolo líquido não deve ser maior do que o diâmetro da pupila do peixe-zebra larva prim 25 (0,21 mm, produzindo uma esfera de 4,9 nL em volume). Ajuste a pressão de acordo, se o bolo líquido é demasiado grande ou demasiado pequeno. </li><li> Anestesiar os peixes no tricaina sulfonato de metano (200 ug / mL). Uma vez que o peixe ter parado de se mover redemoinho, a cápsula com a tampa na até que o peixe estão no centro. Recolha 50 peixes com uma pipeta de transferência (Fisher Scientific). Toque no lado da pipeta para resolver os peixes para a ponta. Suavemente pipetar peixe para o prato de agarose larval utilizando como líquido pouco quanto possível. </li><li> Linha do peixe com uma vareta de vidro liso (ter cuidado para não esmagá-los!). Aspirar a forma de líquido tanto quanto possível fora do prato. Use um Kimwipe para afastar qualquer umidade. </li><li> Coloque o prato de agarose larval de peixes sob o microscópio, até obter uma boa visão do peixe e da agulha, ao mesmo tempo. Mova a agulha de vidro para o peixe. Zoom sobre os peixes eo agulha como você posicionar a agulha para o peixe. Cuidadosamente, mover a agulha de vidro na vesícula ótica 27, 29 (orelha) do primeiro peixe. Você saberá uma vez que você mudou a agulha para o peixe, porque quando você aperta o pedal (Instrumentos Científica Aplicada), o ventrículo rombencéfalo vai levantar um pouco. </li><li> Pressione o pedal (Applied Scientific Instruments) e assistir o líquido disperso dentro rombencéfalo do peixe ventrículo 27. Retrair a agulha do peixe e passar para o peixe que vem. Repita o procedimento até que você tenha injetado todo o peixe no prato. Remova qualquer dpeixe ead e injetar substituições para manter o número correto (50 peixes). Para cada grupo de 50 peixes injetado uma agulha microinjeção novo deve estar preparado, ou o C. albicans se deposita no fundo da agulha e entope-lo, ou lança a concentração injectado. </li><li> Lave o peixe fora do prato por prato e dobrar a pulverização de ovo de água para o peixe em uma placa de Petri limpa extra profundo contendo 60 mL de ovo e água. É importante não deixar o peixe na agarose por mais 15-20 minutos, ou eles irão secar e morrer. </li><li> Repita o processo até terminar toda a injeção. Não se esqueça PBS e não-patogênicas controles injetados. </li><li> Quando terminar, manter o peixe a 28 ° C. </li><li> Feche a válvula do tanque de nitrogênio. Mova o interruptor unidade de injeção de &quot;pulso&quot; para &quot;contínuo&quot; para aliviar a pressão na linha do tanque, a pressão deve cair a zero neste ponto. Mudar unidade de injeção de volta para &quot;pulso&quot;. Desligue a unidade de injeção e limpar a área de trabalho. </li></ol&gt; 4. Preparando o Peixe for Imaging Duração Experimental: ** (30 minutos) Grau de dificuldade: ** <ol><li> Preparar solução tricaina sulfonato de metano como antes (200 ug / mL). Saia peixes infectados, e transferi-los para tricaina. </li><li> Preparar 47,9 mL de 0,4% de agarose de baixa fusão (VWR Scientific) em ovo-água. Aquecer a solução por microondas. Arrefecer até 37 ° C e adicionar sulfonato de metano tricaina (200 ug / mL) à mistura </li><li> Uma vez que os peixes são imobilizadas em tricaina sulfonato de metano, pipeta peixe indivíduo em uma placa de Petri (VWR Scientific) contendo 0,4% de agarose de baixo de fusão (VWR Scientific). </li><li> Em seguida, mova o peixe de baixa fusão agarose em poços individuais de um prato fundo de vidro (MatTek Corporation) para a imagem latente. Use tão pouco baixo de fusão de agarose quanto possível de modo que o peixe fica encostado ao fundo do prato. Apenas usar o suficiente do tricaina-agarose para encher o emcírculos parceiras do prato fundo de vidro. </li></ol> 5. Modificações relacionadas a Jove Protocolos Micropipetas de microinjeção Duração Experimental: * (10-15 minutos) Grau de dificuldade: * <ol><li> Puxar hastes de vidro ocas BF120-69-10 (Sutter Instruments) utilizando um flamejante Brown Micropipeta Puller Modelo P-97 (Sutter Instruments) de acordo com Yuan et ai. 30. Escolha o programa # 7 com o Heat condições seguinte = 470 Velocidade, Tempo = 120 = 200. A agulha resultante é de 8 mm a partir de bisel à ponta e, uma vez cortada a 3 mm acima da ponta tem um diâmetro de cerca de 10 uM. </li><li> Carregar uma micropipeta de vidro nos suportes. Selecione &quot;Puxar&quot;. O filamento de aquecimento irá aquecer a agulha de acordo com os parâmetros do programa, a vareta de vidro vai separar em duas micropipetas puxadas. Micropipetas Loja em uma caixa de armazenamento pipeta (Suttinstrumentos de ER). </li></ol> Colheita de embriões, Injeção Morfolino e Manutenção Experimental: *** duração (1-2 horas) Grau de dificuldade: *** <ol start="3"><li> Recolher embriões de acordo com os métodos de Rosen et al. 31. Use uma peneira plástica (Wares de Knutsford) para coletar os ovos a partir do tanque de desova (Habitats Aquáticos). Segure a peneira de cabeça para baixo sobre uma placa de Petri extra profundo e enxágüe com água do tanque para coleta de ovos. </li><li> Para a preparação morfolino, adicionam-se 300 uL de água estéril para 300 nanomoles de morfolino (GeneTools, LLC). Isto dá um estoque de trabalho de 1,0 mM. </li><li> Verificar a concentração do morfolino usando um Nanodrop (Thermo Scientific). Seleccione &quot;ácido nucleico e alterar o tipo de amostra a&quot; outro &quot;comprimento de onda e 265. Introduza a constante através da multiplicação do peso molecular do morfolino por 1000 dividido pelo absorptivitcoeficiente de y listados na folha de propriedades morfolino oligo. </li><li> Nanodrop o ensaio em branco com 2 uL 0,1 N de HCl. Diluir 5 uL da solução de morfolino em 95 uL de 0,1 N HCl (20x de diluição). Coloque 2 uL da diluição sobre o pedestal e nanodrop medida clique. Multiplicar a concentração pelo fator de diluição (20). Isto dá uma concentração de trabalho de morfolino. Para calcular a concentração milimolar dividir a concentração obtida pelo peso molecular do morfolino. </li><li> Preparar um estoque de trabalho de morfolino em Danieau tampão (58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM de Ca (NO3) 2, 5,0 mM de HEPES, pH 7,6) e 0,01% de vermelho de fenol (VWR Scientific). </li><li> Para morfolino trabalho injecção seguir o protocolo de acordo com Rosen et al. 31 e et Yuan ai. 30. Lavar os pratos de injecção morfolino com ovo em água e aquecido a 28 ° C durante 15 minutos. Retire a água dos pratos de injeção e line-up de um cell embriões em fase para dentro das ranhuras do prato de injecção (preparado a partir de secção 1) com uma pipeta de transferência. Cada placa irá realizar cerca de 250 ovos. Injectar 1-2 embriões em fase de células com morfolino. Ovos irá permanecer na fase de uma célula-por 15 minutos 27. </li><li> Lavar os ovos injectados com ovo em água quando acabados (água desionizada estéril com 60 mg / l sais Instant Ocean) e colocar em 60 mL de ovo de água-em placas de Petri extras profundas. Pratos de injeção morfolino pode ser reutilizado. Enxágüe com água-ovo quando terminar e armazenar invertido a 4 ° C. </li><li> Para o armazenamento de embriões adicionar 60 mL de água-ovo de prato. Contar 110 embriões com uma pipeta de transferência em separadas adicionais placas de Petri de profundidade com 60 mL de ovo-água. Adicionar metileno 0,00003% de azul para impedir o crescimento microbiano e embriões incubar a 28 ° C. </li><li> Para acelerar o desenvolvimento de embriões manter pratos de embriões a 33 ° C durante 24 horas e fase de acordo com Kimmel et ai. 27, permitindo que os embriões para desenvolver a uma cabeçaângulo de tronco de 75 ° (fase Prim 25 27). </li><li> Para o trabalho infecção de larvas manter embriões a 28 ° C após injecção com C. albicans. </li><li> Cada dia substituir pratos embrião com 60 mL de água doce de ovos. </li></ol> Imagem Duração Experimental: ***** (1-5 horas) Grau de dificuldade: *** <ol start="14"><li> Prepare peixe em baixa fusão agarose (de acordo com a secção 4.2) com tricaina em pratos de vidro de fundo de imagem (MatTek Corporation) como descrito anteriormente. Coloque o prato em um IX-81 Olympus platina do microscópio (Olympus) invertido. Trazer o peixe para o foco no aumento de 4x em contraste de interferência diferencial (DIC) de luz. As imagens podem ser capturadas em 4x, 20x e 40x no DIC, TRITC (isotiocianato de rodamina tetrametil), e FITC (isotiocianato de fluoresceína) configurações do filtro. </li><li> Use uma Olympus IX-81 microscópio invertido com uma FV-1000 a laser confocal sistema de digitalização de acordo com a Ariga et al. 32. Realizar cursos de tempo em 40x definindo Z-pilhas com 1-1,5 mM fatias a cada hora de infecção. </li><li> Para imagem muito tempo com decurso de 2 horas ou mais, colocar uma camada de baixa massa fundida de agarose na parte superior do peixe no prato de imagem a cada 2-3 horas. Isto evita que a agarose de secar e esmagamento do peixe enquanto está a ser trabalhada. Para os cursos de tempo prolongados com um pequeno número de peixe, utilizar uma fase aquecida (Bioptechs Inc.) para manter a 28 ° C durante as infecções. </li></ol> 6. Os resultados representativos Um exemplo de sucesso rombencéfalo ventrículo C. albicans infecção em uma larva do peixe-zebra, 5 horas pós-infecção (HPI) e 24 hpi é mostrado na (Figura 1). Macrófagos como células com C. engolfou albicans são vistas no ventrículo rombencéfalo a 5 hpi. Em 24 hpi, C. albicans está dentro de macrófagos como células no tecido da cauda dorsal indicativa de candidíase disseminada. Este resultado infecção é altamente dependente de uma injecção precisa de 10-15 levedura forma C. albicans no ventrículo rombencéfalo. Triagem de peixes infectados imediatamente após a injecção pode garantir isso. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Figura 1 transgênica fli1:. EGFP 22, 33 larva infectados com Candida albicans CaF2-yCherry e fotografada intravitally por microscopia confocal. (AC) de 5 horas pós-infecção (A) larva infectada com EGFP-expressando macrófagos, como as células no local da infecção (rombencéfalo ventrículo) Barra de escala = 100 uM. (B e C) mais elevadas imagens de ampliação de peixe mesmo, mostrando C. albicans dentro fagócitos. Barra de escala = 100 mm para B e 10 M para C. (DF) 24 horas após a infecção larva (D) infectados com candidíase disseminada com CaF2-yCherry C. albicans dentro EGFP macrophage-like células no tecido de cauda dorsal. Barra de escala = 100 mm. (E e F) Superior imagens de ampliação do mesmo peixe, mostrando C. albicans no tecido de cauda. Barra de escala = 100 mm.

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de microinjecção peixe-zebra aqui apresentado difere da Gutzman et al. 34 em que aqui se demonstrar a injecção através da vesícula ótica para o ventrículo rombencéfalo de 36-48 larvas hpf. O método permite que descrevemos injectável consistente de 10-15 levedura para o ventrículo rombencéfalo com danos nos tecidos reduzida. Este protocolo produz uma infecção local que inicialmente se espalha em todo o corpo por 24 hpi (Figura 1) e resulta em letalidade signif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tanques de desova </td><td> Habitats aquáticos </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 ml tubos </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Extra profundo placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Padrão placas de Petri </td><td> VWR Scientific </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de transferência </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de levedura </td><td> VWR científic </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro descartável </td><td> VWR Scientific </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Dumoxel Pinças </td><td> VWR Scientific </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Cavilhas de madeira </td><td> VWR Scientific </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> KimWipes </td><td> VWR Scientific </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Low MeltAgarose </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose para pratos de injeção </td><td> VWR Scientific </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Ocos bastões de vidro </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> Para bastões de vidro vidro liso por aquecimento sobre Bico de Bunsen </td></tr><tr><td> Pipetar Caixa de armazenamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Sistema de injecção </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de pressão Voltar </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta kit Titular </td><td> Aplicaçãoed Instrumentação Científica </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Foot Switch </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Base Magnética </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td> Base Magnética </td><td></td></tr><tr><td> Tricaina sulfonato de metano </td><td> Ocidental Chemical Inc. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando Âmbito </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 base de SZX-ILLB2 top-100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 com FV-1000 sistema de varredura a laser confocal </td><td></td></tr><tr><td> TC-7 Tissue monocilíndrico Cultura com 14 polegadas roda tubo de ensaio </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Pratos de imagem </td><td> MatTek Corporação </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Ponteira para colocar as agulhas </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Grades Placa vazamento </td><td> Ferramentas adaptativas Ciência </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio aquecida </td><td> Bioptechs Inc. </td><td> Delta T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Espátula Plana </td><td> VWR Scientific </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Peneiras de plástico </td><td> Wares de Knutsford online </td><td> 12 centímetros </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Scientific </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Scientific </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm tubos de cultura </td><td> VWR Scientific </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de Fenol </td><td> VWR Scientific </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> VWR Scientific </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4534-500gP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4532-500gP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0246-500gP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO3) 2 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0226-500gP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4520-500gP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

Candidíase disseminada causada pelo patógeno Cândida albicans é um problema clínico importante em indivíduos hospitalizados e está associada com uma mortalidade de 30 a 40% atribuível 6. A candidíase sistêmica é normalmente controlada pela imunidade inata, e indivíduos com defeitos genéticos em células imunes inatas componentes, tais como NADPH oxidase de fagócitos são mais suscetíveis à candidemia 7-9. Muito pouco é conhecido sobre a dinâmica de C. albicans interacção com as células imunes inatas in vivo. extensa em estudos in vitro demonstraram que fora do hospedeiro C. albicans germina dentro de macrófagos, e é rapidamente destruída por neutrófilos 10-14. Os estudos in vitro, embora úteis, não pode recapitular o complexo in vivo ambiente, que inclui dependentes do tempo dinâmica dos níveis de citocinas, anexos da matriz extracelular, e os contactos intercelulares 10, 15-18 </sup&gt;. Para investigar a contribuição desses fatores no sistema patógeno-hospedeiro interação, é fundamental para encontrar um organismo modelo para visualizar estes aspectos da infecção não-invasiva em um hospedeiro vivo intacto. A larva do peixe-zebra oferece um hospedeiro vertebrado único e versátil para o estudo da infecção. Durante os primeiros 30 dias de desenvolvimento larvas do peixe têm apenas inatas defesas imunitárias 2, 19-21, simplificando o estudo de doenças como a candidíase disseminada que são altamente dependentes da imunidade inata. O tamanho pequeno e transparência das larvas do peixe permitir imagem de dinâmica da infecção a nível celular, tanto para hospedeiro e do patógeno. Larvas transgénico com fluorescentes inatos células do sistema imunológico pode ser usado para identificar os tipos específicos de células envolvidas na infecção 22-24. Modificados oligonucleótidos anti-sentido (Morpholinos) pode ser usado para derrubar vários componentes imunológicos, tais como NADPH oxidase de fagócitos e estudar as alterações em resposta a fungal infecção 5. Além das vantagens éticas e práticas da utilização de um vertebrado pequeno inferior, as larvas do peixe-zebra oferece a possibilidade única para a imagem da batalha lançada entre patógeno e tanto intravitally e na cor. O peixe-zebra tem sido utilizada para a infecção modelo para um número de bactérias patogénicas humanas, e tem sido instrumental em grandes avanços na compreensão da infecção micobacteriana 3, 25. No entanto, só recentemente patógenos muito maiores, tais como fungos foram utilizados para infectar larvas 5, 23, 26, e até à data não tem havido uma descrição detalhada visual da metodologia infecção. Aqui apresentamos as nossas técnicas de microinjeção rombencéfalo ventrículo de zebrafish 25 prim, incluindo os nossos alterações aos protocolos anteriores. Nossos resultados utilizando o modelo de zebrafish larval para infecção fúngica divergem dos estudos in vitro e reforçam a necessidade de examinar a Intera patógeno-hospedeiroction no complexo ambiente do hospedeiro em vez do sistema simplificado da placa de Petri 5.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de infecção<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Aqui demonstramos técnicas para infectar larvas do peixe utilizando o agente patogénico fúngica<em&gt; Candida albicans</em&gt; Por microinjeção, a metodologia usada recentemente para implicar atividade oxidase NADPH de fagócitos no controle de dimorfismo fúngico<sup&gt; 5</sup&gt;.

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

non-invasive-imaging-of-disseminated-candidiasis-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K visualizações.  University of Maine. O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de infecção 1-4. Aqui demonstramos técnicas para infectar larvas do peixe utilizando o agente patogénico fúngica Candida albicans Por microinjeção, a metodologia usada recentemente para implicar atividade oxidase NADPH de fagócitos no controle de dimorfismo fúngico 5.

Vídeo: Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Timectomia completo em ratos adultos com não-invasiva entubação endotraqueal

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...