Nosso método ajuda a estudar a cinética de uma formação complexa de proteínas. Descreve o quão apertado é um complexo proteico, e se a formação do complexo proteico é interferida por outras proteínas. Essa técnica permite estudar a interação proteína-proteína de forma quantitativa usando fluorescência como repórter, nosso ensaio pode monitorar a associação e a dissociação de um complexo proteico em tempo real.
Para começar, desenhe o ensaio FRET a partir dos dados do complexo COL1 CAND1 do banco de dados de proteínas. Carregue a estrutura em PyMOL e, em seguida, vá para o menu do assistente e use a função de medição para estimar a distância entre o primeiro aminoácido do CAND1 e o último aminoácido de COL1. Em seguida, carregue o visualizador de espectros on-line e visualize os espectros de excitação e emissão de 7-amino-4-metilcoumarina e FlASH simultaneamente.
A AMC é o doador da FRET e FlASH é o aceitador da FRET. Prepare as células com a proteína do doador FRET seguindo o protocolo de texto que acompanha. Em seguida, purifique o complexo COL1 sortase RBX1 adicionando primeiro 50 mililitros de tampão de lise a uma pelota de células E.Coli expressando o complexo COL1 sortase RBX1.
Gelo as células no gelo com sônicação a 50%de amplitude. Alterne a potência por três minutos para que ela esteja um segundo ligado e, em seguida, um segundo de folga para evitar superaquecimento da amostra. Transfira o lise celular resultante para um tubo de centrifugação de 50 mililitros e remova os detritos celulares por centrifugação a 25.000 vezes g durante 45 minutos.
Em seguida, adicione o supernatante a cinco mililitros de contas de glutationa e incuba-as a quatro graus Celsius para limpar o lisetê celular. Após a incubação, centrifugar a mistura de lise de contas a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Então, remova o supernatante.
Em seguida, lave as contas com 5 mililitros de tampão de lise sem inibidor de protease. Depois de centrifuging a solução, remova o supernante. Agora, adicione três mililitros de tampão de lise às contas lavadas e transfira o chorume de contas para uma coluna vazia.
À nova coluna, adicione também cinco mililitros de tampão de elução e, em seguida, incubar a coluna por 10 minutos e coletar o elunato. Em seguida, adicione 200 microliters de trombina a cinco miligramas por mililitro ao eluato das contas de glutationa. Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius diluir a amostra de proteína três vezes com tampão A.Carregue a amostra de proteína para um tampão Uma coluna de cromatografia de troca cônica equilibrada em zero ponto cinco mililitros por minuto.
Em seguida, adicione um gradiente de zero a 50% de tampão B no buffer A para elutar a proteína com uma taxa de fluxo de 1 mililitro por minuto. Em seguida, acumule as frações eluadas contendo a proteína do doador FRET e concentre-a até dois pontos cinco mililitros usando uma membrana de ultrafiltração com um corte de 30 kilodalton. Agora, adicione 7-amino-4-metilcoumarina ao c-terminus de COL1 através da transpeptidação mediada de classificação, mudando primeiro o buffer na amostra de proteína do doador FRET no buffer de separação usando uma coluna de dessalgação.
Para isso, equilibre primeiro uma coluna de desalamento com 25 mililitros de tampão de tipo. Em seguida, carregue dois pontos cinco mililitros da solução de proteína doadora FRET na coluna e descarte o fluxo através. Em seguida, elute a amostra com três pontos cinco mililitros de tampão de tipo e coletar o fluxo através.
Em 900 microlitadores do eluato, adicione 100 microlitres de 600 micromolar purificados uma solução e 10 microliters de um peptídeo GGGG-AMC de 25 mililitros. Incubar a mistura de reação a 30 graus Celsius no escuro durante a noite para gerar COL1-AMC-RBX1. Agora, carregue toda a amostra na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho e elute-a com um ponto cinco vezes o volume da coluna de buffer.
No final, acumule as frações eluadas contendo COL1-AMC-RBX1. Acompanhe o protocolo de texto para preparar a proteína aceitadora de FRET. Muitas das etapas são semelhantes à preparação da proteína do doador FRET.
Uma vez concluída, prepare a solução FlASH CAND1. Primeiro, adicione um microliter da solução FlASH a 50 microliters da solução tetra-cys-CAND1 recém-preparada. Misture bem as soluções combinadas e incubar a mistura à temperatura ambiente no escuro por uma a duas horas para formar a solução FlASH CAND1.
Em 300 microliters de buffer FRET, adicione COL1-AMC-RBX1 a uma concentração final de 70 nanomolares e transfira a solução para um cuvette. Coloque a cuvette no suporte amostral de um fluorômetro. Excite a amostra com 350 nanômetros de luz de excitação e escaneie os sinais de emissão de 400 a 600 nanômetros em incrementos de um nanômetro.
Em seguida, em 300 microliters de buffer FRET, adicione tanto COL1-AMC-RBX1 quanto FlASH-CAND1 a uma concentração final de 70 nanomolar. Excite a amostra com 350 nanômetros de luz de excitação e escaneie os sinais de emissão de 400-600 nanômetros em incrementos de um nanômetro. Coloque a luz de excitação em 350 nanômetros e use um filtro de passagem de banda que permite que 450 nanômetros de luz de emissão passem e bloqueie 500 a 650 nanômetros de luz de emissão.
Com as válvulas de amostra na posição de preenchimento conecte uma seringa de três mililitros cheia de água. Em seguida, lave as duas seringas de amostra com água movendo a seringa amostra para cima e para baixo várias vezes, descartando a água quando terminada. Em seguida, conecte uma seringa de três mililitros cheia com tampão FRET.
Lave as duas seringas de amostra com o tampão FRET movendo a unidade de seringa amostra para cima e para baixo várias vezes, descartando a água quando terminada. Agora, conecte uma seringa de três mililitros e carregue a primeira seringa de amostra, seringa A, com 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 no buffer FRET. Em seguida, gire a válvula de amostra para a posição de acionamento Também, conecte uma seringa de três mililitros à seringa B e carregue a seringa B com 100 nanomolar de FlASH CAND1 no buffer FRET e gire sua válvula para a posição de acionamento.
Abra o painel de controle adquirido no software e regise a emissão de COL1-AMC ao longo de 60 segundos. Então, dê um único tiro. Encaixe a diminuição e os sinais fluorescentes medidos ao longo do tempo de cada tiro para uma única curva exponencial.
Lave o sistema como mostrado anteriormente e adicione uma solução de 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 e 100 nanomolar FlASH CAND1 no buffer FRET em seringa A.Conecte-o ao sistema enquanto estiver na posição de preenchimento Carregue a seringa A e, em seguida, gire a válvula de amostra para a posição de acionamento. Em seguida, carregue uma solução de Skp1-Skp2 em seringa B.Conecte-a ao sistema enquanto estiver na posição de preenchimento. Carregue a seringa B e, em seguida, gire a amostra para a posição da unidade.
No software, vá para adquirir e abrir o painel de controle. Configure o programa para registrar a emissão de COL1-AMC em 30 segundos. Então dê um único tiro.
Os sinais de fluorescência aumentam ao longo do tempo após a mistura de soluções de seringa A e seringa B.Quando 70 nanomolars cada um de COL1-AMC e FlASH CAND1 foram misturados para gerar FRET, dois picos de emissão estavam presentes nos espectros de emissões. E o pico de COL1-AMC ficou mais baixo, e o pico do FlASH CAND1 tornou-se mais alto. Quando o cand1 de comprimento completo foi utilizado para fret o pico do doador mostrou uma redução de 10% na intensidade.
No entanto, quando o CAND1 com sua primeira hélice truncada foi usado a redução da intensidade de pico do doador foi aumentada para 30% sugerindo maior eficiência de FRET Para confirmar que as mudanças de sinal foram resultantes de FRET entre COL1-AMC e FlASH CAND1, o DOADOR FRET foi misturado com o excesso de CAND1 não rotulado conhecido como Chase no acceptor. Como resultado, o pico do doador foi totalmente restaurado e o pico do aceitador foi diminuído. Mostrado aqui é um gráfico do valor K médio observado com a concentração CAND1 após análise de regressão linear.
Para medir a constante do complexo, 50 nanomolar COL1-AMC foram utilizados em uma série de constantes de taxa de dissociação observadas foram medidas pela mistura de 50 nanomolar COL1-AMC com concentrações crescentes de FlASH CAND1. Semelhante à medição do on constante, a constante de dissociação observada de COL1 e CAND1 foi encontrada monitorando a restauração do sinal doador ao longo do tempo no fluorômetro de fluxo parado. Aqui o sinal do doador aumentou rapidamente e revelou um valor K observado de zero ponto quatro por segundo.
Em contraste, quando o buffer foi adicionado ao complexo pré-montado, não foi observado aumento de sinal sugerindo que a rápida dissociação do COL1 CAND1 foi desencadeada pelo Skp1 Skp2. Certifique-se de minimizar a quantidade de luz a que o doador e as proteínas aceitadoras estão expostas. Tente manter fluoroforos no escuro o máximo possível.
