השיטה שלנו מסייעת ללמוד את הקינטיקה של היווצרות מורכבת חלבון. הוא מתאר עד כמה הדוק קומפלקס חלבון, ואם היווצרות חלבון מורכב הוא התערב על ידי חלבונים אחרים. טכניקה זו מאפשרת ללמוד אינטראקציה חלבון-חלבון באופן כמותי באמצעות פלואורסצנטיות ככתב, המבחן שלנו יכול לפקח על הקשר והניתוק של קומפלקס חלבון בזמן אמת.
כדי להתחיל, תכנן את המדגימה FRET החל מהנתונים עבור קומפלקס COL1 CAND1 ממסד הנתונים של החלבון. טען את המבנה ב- PyMOL ולאחר מכן עבור לתפריט האשף ולהשתמש בפונקציית המדידה כדי להעריך את המרחק בין חומצת האמינו הראשונה של CAND1 לבין חומצת האמינו האחרונה של COL1. לאחר מכן, לטעון את הצופה ספקטרה באינטרנט ולהציג את ספקטרום העירור והפיכה של 7-אמינו-4-מתילקומארין ו FlASH בו זמנית.
AMC הוא תורם FRET ו FlASH הוא מקבל FRET. הכן תאים עם חלבון התורם FRET על ידי ביצוע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, לטהר את קומפלקס COL1 sortase RBX1 על ידי הוספת תחילה 50 מיליליטר של מאגר תיזה לכדור של תאי E.Coli המבטאים את קומפלקס RBX1 RBX1 קולי.
קרח התאים על קרח עם sonication ב 50% משרעת. החלף את הכוח למשך שלוש דקות כך שהוא יעבור שנייה אחת ולאחר מכן שניה אחת כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה. העבר את התא שנוצר lysate לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 25, 000 פעמים g במשך 45 דקות.
לאחר מכן, מוסיפים את העל-טבעי לחמישה מיליליטר של חרוזי גלוטתיון ומדגירים אותם בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות את התא. לאחר הדגירה, צנטריפוגה תערובת ליאזט חרוז ב 1, 500 פעמים גרם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי.
לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 5 מיליליטר של חיץ תיזה ללא מעכב פרוטאז. לאחר צנטריפוגה הפתרון, להסיר את העל טבעי. עכשיו, להוסיף שלושה מיליליטר של חיץ תזה לתוך חרוזים שטופים ולהעביר את תרחיף חרוזים לתוך עמוד ריק.
לעמודה החדשה, הוסף גם חמישה מיליליטר של מאגר אלוטיון ולאחר מכן הדגירה את העמודה במשך 10 דקות ולאסוף את eluate. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של טרומבין בחמישה מיליגרם למיליליטר לאלוטה חרוזי הגלוטתיון. לאחר דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס לדלל את דגימת החלבון שלוש פעמים עם חיץ A.Load דגימת החלבון למאגר עמוד כרומטוגרפיה חילופים cationic מנוון בנקודת אפס חמישה מיליליטר לדקה.
לאחר מכן, הוסיפו שיפוע של אפס עד 50% של מאגר B במאגר A כדי לחמק מהחלבון עם קצב זרימה של מיליליטר לדקה. לאחר מכן, בריכת שברי eluate המכילים את החלבון תורם FRET ולרכז אותו עד שתי נקודות חמישה מיליליטר באמצעות קרום אולטרה סינון עם ניתוק 30 קילודלטון. עכשיו, להוסיף 7-אמינו-4-מתילקומארין c-terminus של COL1 באמצעות טרנספפטידה מתווית sortase על ידי שינוי הראשון את המאגר בדגימה חלבון תורם FRET לתוך מאגר sortase באמצעות עמודת התפלה.
כדי להשיג זאת, תחילה לצייד עמודת התפלה עם 25 מיליליטר של מאגר sortase. לאחר מכן, לטעון שתי נקודות חמש מיליליטר של פתרון חלבון תורם FRET לתוך העמודה ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן, לחמק המדגם עם שלוש נקודות חמש מיליליטר של חיץ sortase ולאסוף את הזרימה דרך.
ב 900 microliters של eluate, להוסיף 100 microliters של 600 micromolar מטוהרים sortase פתרון ו 10 microliters של פפטיד GGGG-AMC 25 מילימולר. הדגירה את תערובת התגובה ב 30 מעלות צלזיוס בחושך לילה כדי ליצור COL1-AMC-RBX1. עכשיו, לטעון את כל המדגם על העמודה כרומטוגרפיה אי הכללת גודל ולחמק ממנו עם נקודה אחת חמש פעמים את נפח העמודה של המאגר.
בסופו של דבר, אסוף את שברי ה- ELUATE המכילים COL1-AMC-RBX1. בצע יחד בפרוטוקול הטקסט כדי להכין את חלבון מקבל FRET. רבים מהצעדים דומים להכנת החלבון התורם FRET.
לאחר סיום, להכין את פתרון FLASH CAND1. ראשית, הוסיפו מיקרוליטר אחד של פתרון FlASH ל-50 מיקרוליטרים של פתרון הטטרה-ציסטה-CAND1 שהוכן טרי. מערבבים היטב את הפתרונות המשולבים ומדרגים את התערובת בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה עד שעתיים כדי ליצור את פתרון FlASH CAND1.
ב 300 microliters של מאגר FRET, להוסיף COL1-AMC-RBX1 לריכוז סופי של 70 nanomolar ולהעביר את הפתרון לתוך קובט. מניחים את ה cuvette במחזיק מדגם של פלואורימטר. לרגש את המדגם עם 350 ננומטר אור העירור ולסרוק את אותות הפליטה מ 400 כדי 600 ננומטר במרווחים ננומטר אחד.
לאחר מכן, ב 300 microliters של חיץ FRET, להוסיף הן COL1-AMC-RBX1 ו FlASH-CAND1 לריכוז סופי של 70 ננומולרים. לרגש את המדגם עם 350 ננומטר אור העירור ולסרוק את אותות הפליטה מ 400-600 ננומטר במרווחים ננומטר אחד. הגדר את אור העירור על 350 ננומטר ולהשתמש מסנן לעבור הלהקה המאפשר 450 ננומטר פליטת אור לעבור וחוסם 500 כדי 650 ננומטר פליטת אור.
עם שסתומי הדגימה בעמדת המילוי לחבר מזרק שלושה מיליליטר מלא במים. לאחר מכן, לשטוף את שני מזרקים מדגם עם מים על ידי הזזת כונן מזרק מדגם למעלה ולמטה מספר פעמים, השלכת המים כאשר סיים. לאחר מכן, חבר מזרק של שלושה מיליליטר מלא במאגר FRET.
לשטוף את שני מזרקים מדגם עם מאגר FRET על ידי הזזת כונן מזרק מדגם למעלה ולמטה מספר פעמים, השלכת המים כאשר סיים. עכשיו, לחבר מזרק שלושה מיליליטר ולטעון את המזרק מדגם הראשון, מזרק A, עם 100 ננומולאר COL1-AMC-RBX1 במאגר FRET. לאחר מכן להפוך את שסתום המדגם למצב הכונן גם, לחבר מזרק שלושה מיליליטר מזרק B לטעון מזרק B עם 100 nanomolar של FlASH CAND1 במאגר FRET ולהפוך את השסתום שלה למיקום הכונן.
פתח את לוח הבקרה תחת לרכוש בתוכנה ולהקליט את הפליטה של COL1-AMC במהלך 60 שניות. ואז, לקחת ירייה אחת. התאם את הירידה ואת אותות הפלואורסצנט שנמדדו לאורך זמן מכל ירייה לעקומה מעריכית אחת.
לשטוף את המערכת כפי שהוצג קודם לכן ולאחר מכן להוסיף פתרון של 100 ננומולרים COL1-AMC-RBX1 ו 100 ננומולאר FlASH CAND1 במאגר FRET לתוך מזרק A.Connect אותו למערכת בזמן שהוא במצב מילוי טען מזרק A ולאחר מכן להפוך את שסתום המדגם למיקום הכונן. לאחר מכן, לטעון פתרון של Skp1-Skp2 לתוך מזרק B.Connect אותו למערכת בזמן שהוא בעמדת מילוי. טען מזרק B ולאחר מכן הפוך את הדגימה למיקום הכונן.
בתוכנה, עבור כדי לרכוש ולפתוח את לוח הבקרה. הגדר את התוכנית כדי להקליט את הפליטה של COL1-AMC מעל 30 שניות. אז קח ירייה אחת.
אותות הפלואורסצנטיות גדלים עם הזמן לאחר ערבוב פתרונות ממזרק A ומזרק B.When 70 ננומולר כל אחד COL1-AMC ו FlASH CAND1 היו מעורבים כדי ליצור FRET, שתי פסגות פליטה היו נוכחים ספקטרום הפליטה. והפסגה של COL1-AMC הפכה נמוכה יותר, ואת השיא של FlASH CAND1 הפך גבוה יותר. כאשר נעשה שימוש ב- CAND1 באורך מלא עבור FRET, שיא התורם הראה ירידה של 10% בעוצמתו.
עם זאת, כאשר CAND1 עם הסליל הראשון שלה נחתך שימש הפחתת עוצמת שיא התורם הוגדלה ל 30% מציע יעילות FRET גבוהה יותר כדי לאשר כי שינויי האות נבעו FRET בין COL1-AMC ו FlASH CAND1, FRET התורם היה מעורבב עם עודף CAND1 ללא פעמונים המכונה צ'ייס במקבל. כתוצאה מכך, שיא התורמים שוחזר במלואו ושיא המקבלים ירד. מוצג כאן הוא עלילה של ערך K שנצפה הממוצע עם ריכוז CAND1 בעקבות ניתוח רגרסיה ליניארית.
כדי למדוד את הקבוע על המתחם, 50 ננומולרים COL1-AMC שימש בסדרה של קבועים שיעור דיסוציאציה שנצפו נמדדו על ידי ערבוב 50 ננומולרים COL1-AMC עם ריכוזים הולכים וגדלים של FlASH CAND1. בדומה למדידת הקבוע, קבוע הדיסוציאציה שנצפה של COL1 ו- CAND1 נמצא על ידי ניטור שחזור אות התורם לאורך זמן על פלואורומטר הזרימה שנעצר. כאן אות התורם גדל במהירות והוא חשף ערך K שנצפה של נקודת אפס ארבע לשנייה.
לעומת זאת, כאשר המאגר נוסף למתחם שהורכב מראש, לא נצפתה עליית אות המצביעה על דיסוציאציה מהירה של COL1 CAND1 הופעלה על ידי Skp1 Skp2. הקפד למזער את כמות האור החלבונים התורם והמקבל נחשפים. נסה לשמור פלואורופורים בחושך ככל האפשר.
