A síntese de proteínas sem células é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. Os sistemas de síntese de proteínas livres de células não têm parede celular, portanto temos acesso direto a metabólitos. Neste protocolo, quantificamos as medidas absolutas de 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia, o que nos permite caracterizar o metabolismo livre de células.
O protocolo conta com a metástase dos compostos com anilina, o que permite uma melhor separação e maior resolução de espectrometria de massa. Além disso, usamos padrões internos com uma isotópica que rotulamos anilina, para quantificação absoluta dos metabólitos. Os metabólitos marcados coelute, que elimina os efeitos da supressão de ferro.
Permitindo a quantificação precisa dos compostos. Trabalhando em um capô, combine 550 microliters da anilina, com 337,5 microliters de água de grau LC-MS. E 112,5 microliters de 12 ácidos clorídricos molares em um tubo de centrífuga.
Vortex bem, e armazene a solução de seis molar aniline em pH 4,5 e quatro graus Celsius. Para preparar uma solução de anilina de carbono molar de seis molares 13, em pH 4.5, combine 250 miligramas de anilina de carbono-13 com 132 microliters de água, e 44 microlitres de 12 ácidos clorídricos molares. Vórtice bem, e armazenar a quatro graus Celsius.
Para preparar 200 miligramas por solução EDC mililitro, dissolva dois miligramas de EDC em 10 microliters de água para cada amostra a ser marcada. E vórtice bem. Para preparar amostras, sacie e precipitar as proteínas em uma reação de síntese proteica livre de células, adicionando um volume igual de 100% etanol gelado à reação de síntese livre de células.
Centrifugar a amostra a 12.000 vezes g, por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante da amostra para um novo tubo de centrífuga. Para rotular a amostra com solução de anilina de carbono-12, transfira seis microlitadores da amostra para um novo tubo de centrífuga e leve o volume para 50 microliters com água.
Adicione 5 microliters de 200 miligramas por solução EDC mililitro, misture bem a solução de anilina de carbono-12 e transfira 5 microliters para o tubo. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. Depois de duas horas, remova os tubos do agitador e transfira-os para um capô de fumaça.
Adicione 1,5 microlitadores de trietilamina a cada reação para parar a reação de marcação de anilina e estabilizar os compostos. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos. E salve o supernatante.
Para rotular as normas internas com solução anilina de carbono-13, diluir a solução de estoque interno para 80 micromolar com um volume final de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililitros por mililitro, e cinco microliters da solução de anilina de carbono-13 bem misturada. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente.
Após duas horas, remova os tubos do agitador e adicione 1,5 microlitadores de trietilamina à reação em um capô de fumaça. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos e salvar o supernatante. Para adivinhar o padrão interno marcado, e a amostra marcada, misture 25 microliters de cada um em um frasco de autosampler.
E analisar pelo procedimento LC-MS. Em seguida, para criar uma curva padrão para metabólitos não grampeados, primeiro, diluir a solução de estoque de metabólitos não grampeados para diferentes concentrações, com volume de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililiteres e cinco microliters de solução de anilina de carbono-12 para cada concentração.
Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. E prossiga com o tratamento de trietilamina. E centrifugação antes de analisar pela LC-MS como anteriormente.
Após inicializar o LC-MS, de acordo com as instruções do fabricante, injete cinco microliters da amostra na coluna. E adquira as intensidades de íons m mais apropriadas para a amostra anilina de carbono-12. Então, injete cinco microliters da mesma amostra novamente.
E adquirir o m sobre z intensidades de íons para os padrões de anilina de carbono-13 marcados. Neste protocolo, foram quantificados metabólitos que expressavam proteína fluorescente verde em uma síntese proteica sem células baseada em E.coli. 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia foram detectados e quantificados por meio de padrões internos.
Enquanto uma curva padrão para cinco dos metabólitos que não foram marcados com anilina também foi desenvolvida. Os diversos metabólitos envolvidos nessas vias foram uma classe de açúcares fosfoilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleotídeos e cofatores. Além disso, o método possibilitou a separação de pares de isômeros estruturais, como fosfato de glicose-seis e fosfato de frutose-seis em uma única corrida LC-MS.
O passo mais importante é rotular a amostra desem proteína com anilina. Uma vez que a solução anilina se separa, é importante trabalhar de forma rápida e eficaz, mantendo boas práticas de segurança. Este método ajuda a caracterizar o metabolismo livre de células com a quantificação de 40 metabólitos.
Mas, compostos adicionais estão na mistura livre de células, como aminoácidos que podem ser quantificados. Isso ajudaria a fornecer um olhar mais abrangente sobre o metabolismo livre de células. Este método revelou que sistemas livres de células têm metabolismos complexos, ainda operando que podem ser potencialmente explorados para melhor eficiência energética e rendimento de carbono.
O protocolo se baseia em marcar os compostos com anilina com o uso de EDC como catalisador. Ambos os reagentes são perigosos e devem ser usados com cautela.
