A doença inflamatória intestinal, ou DII, impõe uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Este modelo de colite é útil para estudar os mecanismos do IBD e avaliar os tratamentos para o DII. Este modelo de colite de transferência adotiva específica cbir flagellin T do imunodominante fornece insights sobre como o antígeno de bactérias intestinais induz respostas de células T para induzir colite.
Depois de eutanásia do camundongo, faça uma incisão abdominal de aproximadamente um centímetro e puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal. Em seguida, faça uma incisão de aproximadamente três centímetros no tecido muscular abdominal. Em seguida, remova o baço com tesouras estéreis e fórceps.
Coloque o baço em um prato de cultura contendo cinco mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado. Triture o baço com a superfície áspera de duas lâminas de vidro estéreis. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mililitros passando-a através de um filtro de célula de 100 micrômetros.
Enxágüe os slides de vidro e o prato de cultura com cinco mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado, e transfira o tampão de lavagem para o tubo. Centrifugar a suspensão celular, descartar o supernascer e resuspengar as células com cinco mililitros de tampão de cloreto de amônio Tris pré-armado por baço. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado ao tubo. Em seguida, centrifugar a suspensão celular, descartar o supernaspecido e resuspensar as células com 10 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado. Para contar as células, misture 10 microliters cada uma de suspensão celular e azul Trypan completamente, e carregue 10 microliters em um slide.
Em seguida, insira o slide no contador automático de células para obter o número de célula viável. Centrifugar a suspensão restante da célula e descartar todos os supernascentes. Vórtice, as partículas magnéticas CD4 anti-rato, adicionam diretamente 50 microliters das partículas por 10 milhões de células, e se misturam com pelotas de células completamente.
Incubar a mistura por 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a suspensão da partícula celular para um tubo de coleta estéril. Adicione 3,5 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado no tubo.
Coloque o tubo no ímã de separação celular por oito minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire cuidadosamente o supernaspe com uma pipeta de transferência de três mililitros. Remova o tubo do ímã de separação celular.
Em seguida, resuspenco as células com 3,5 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado e coloque o tubo no ímã por quatro minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernatante com uma pipeta de três mililitros. Finalmente, resuspende as células em um mililitro de buffer FACS pré-resfriado.
Para transferir as células para os camundongos receptores, resuspenir as células T4-positivas do Cbir1 TCR para 5 milhões de células por mililitro em 1x PBS. Aqueça os ratos sob uma lâmpada de calor e contenha os ratos usando um conterrante de rato. Injete por via intravenosa 200 microlitadores da suspensão celular na veia traseira dos camundongos.
Depois de eutanásia do camundongo, faça uma incisão de pele média ventral de aproximadamente um centímetro. Puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal. Então, faça uma incisão de três centímetros no tecido muscular abdominal.
Em seguida, identifique o coecum e remova todo o cólon com tesouras estéreis e fórceps. Molhe o cólon com PBS pré-resfriado em um prato de cultura. Incise o cólon longitudinalmente, e enxágue-o com PBS pré-resfriado.
Corte 1/3 do cólon longitudinalmente. Coloque a tira do cólon em uma toalha de papel com o lado lumenal voltado para cima. Faça a rolagem suíça usando um palito de dente.
Coloque o cólon suíço em um, e coloque o em formalina 10% tamponada por 24 horas. Desidratar e incorporar o cólon com um processador automatizado. Em seguida, corte seções de tecido de cinco micrômetros em um microtoma.
Monte o tecido em lâminas e realize a hematoxilina e a coloração de eosina. Os ratos de rag começaram a perder peso em torno de três semanas de transferência pós-célula, e seu peso atingiu cerca de 80 a 85% de seu peso original seis semanas de transferência pós-célula. Os camundongos receptores mostraram curta duração do cólon seis semanas após a transferência de células.
Os camundongos receptores demonstraram mais infiltração celular na lamina propria intestinal quatro semanas após a transferência celular. Eles mostraram perda de células de cálice e hiperplasia de células epiteliais intestinais cinco semanas após a transferência de células, bem como erosão mucosa e infiltração celular inflamatória na submucosa do cólon seis semanas pós-transferência celular. Os escores histopatológicos aumentaram substancialmente de quatro para seis semanas.
Simultaneamente, não houve inflamação em ratos de rag knockout recebendo PBS sozinho. Com este procedimento, os níveis de citocinas coloniais poderiam ser determinados por ELISA e qPCR.
