Nossos ensaios podem ser usados para testar compostos para seus efeitos na função celular humana. Especificamente, esses métodos podem ser usados para rastrear rapidamente e facilmente um grande número de compostos para seus efeitos na sinalização de cálcio e reação acrosma em células de esperma humanos. Demonstrações visuais deste método tornarão mais fácil para outros configurar experimentos semelhantes em seus próprios laboratórios.
Comece colocando um tubo de 50 mililitros por um mililitro de amostra de sêmen bruto em um rack de tubo em um ângulo de 45 graus e adicionando quatro mililitros de fluido tubal humano de 37 graus Celsius ou meio positivo HTF para cada tubo. Em seguida, pipeta cuidadosamente um mililitro de amostra de sêmen liquefeito para o fundo de cada tubo e coloque os tubos a 37 graus Celsius por uma hora. No final da incubação, use uma ponta de pipeta modificada mantida em um ângulo de 45 graus para transferir suavemente o máximo da fração superior de célula de espermatozoides que contém o meio positivo HTF possível em um novo tubo plástico de 15 mililitros.
Para contar as células coletadas de esperma, diluir uma alíquota de 20 microliter a um fator de 10, 20, 30, 50 ou 90 em tampão S100 em um tubo de dois mililitros de fundo redondo de acordo com a concentração esperada. Vórtice as células de esperma diluídas por 10 segundos a 700 rotações por minuto. Em seguida, mergulhe uma fita SP1 na amostra e deprimi o êmbolo branco para aspirar uma alíquota da amostra no.
Em seguida, coloque o na bandeja do citômetro de imagem e execute o ensaio do esperma humano manchado de PI de acordo com o fator de diluição aplicado. Para medir as mudanças na concentração de cálcio intracelular livre, pipeta suavemente a amostra de esperma uma vez e use uma pipeta repetidora automática para aliquot 50 microliters de células de esperma manchadas de fluoróforo para 24 poços de uma fileira de uma placa de 384 micro poços. Coloque a placa de micro poço no leitor de placa de fluorescência a 30 graus Celsius e selecione o protocolo apropriado para fluoróforo.
Selecione um poço na linha de células espermatozoides e ajuste o ganho para um valor-alvo de 20% Em seguida, inicie a medição. Após 10 ciclos de linha de base, pausa o experimento e ejete a gaveta com a placa de micro poço. Usando uma pipeta de 12 canais, adicione rapidamente 25 microliters das soluções preparadas de compostos e controles de interesse nos 12 poços duplicados da linha e devolva imediatamente a placa ao leitor para continuar a medição o mais rápido possível.
Quaisquer alterações na fluorescência em resposta à adição dos compostos ou controles serão capturadas pelo instrumento. Para análise de reação acrosma, após a incubação das células de esperma capacitadas com os corantes fluorescentes, compostos ou controles fluorescentes apropriados, misture as amostras por pipetação e adicione 50 microliters de cada amostra de teste a 100 microliters de solução imobilizadora. Misture as amostras novamente e carregue as câmaras de um slide A2 por amostra com aproximadamente 30 microliters de amostra por câmara.
Em seguida, coloque o primeiro slide carregado na bandeja do citômetro de imagem. Selecione o Protocolo FlexiCyte e pressione Executar. Aqui resultados representativos de um experimento testando o efeito de quatro compostos, um controle positivo de progesterona e um controle tampão negativo usando o ensaio de sinalização de cálcio de rendimento médio como demonstrado pode ser observado.
Neste gráfico, mostra-se uma curva de resposta de dose de progesterona derivada de alterações de pico de porcentos na concentração de cálcio livre intracelular induzida pela concentração diluída em série de progesterona. Esses dados ilustram os efeitos de um negativo ou um dos dois controles positivos sobre a indução de uma reação acrosuma em células de esperma humano capacitadas em um ensaio de reação acrosum. Para evitar perder os picos dos sinais induzidos, é fundamental adicionar os produtos químicos rapidamente aos poços de replicação e continuar imediatamente a medição posteriormente.
Ao alterar o tipo de fluoroforos e corantes, nossos ensaios podem ser facilmente modificados para responder a diferentes questões científicas. Esses ensaios já foram usados em vários estudos para testar grandes grupos de compostos por seus efeitos na função do esperma humano.
