Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T).

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE2 com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente.
1. Coleta e lavagem de espermatozoides
<ol><li>Coletar espermatozoides epididimais caudais (mais detalhes sobre este procedimento são fornecidos em11) de camundongos AcroSensE. Permitir 15 min de procedimento de nadar em uma placa de cultura de tecidos de 3,5 cm contendo 0,5 mL de meio de Whitten modificado (MW) a 37 °C. A placa deve ser coberta para reduzir a evaporação do MW, e deve ser inclinada para que o meio tenha profundidade suficiente para cobrir a cauda dos epidídimos. NOTA: O meio de Whitten modificado (MW) inclui 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM ácido pirúvico, 4,8 mM ácido láctico hemi-Ca2+ sal, pH 7,35. Glicose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) e 2-hidroxipropil-ciclodextrina (CD; 3 mM) são suplementados (ver Tabela de Materiais) conforme necessário para indução de capacitação, e as concentrações podem ser modificadas para experimentos específicos. Além disso, aceptores alternativos de esterol poderiam ser usados em vez de CD (por exemplo, albumina de soro bovino ou lipoproteínas de alta densidade).</li>
	<li>Usando pinças finas, remova qualquer tecido epididimal da placa de coleta de natação. Transfira o meio contendo os espermatozoides para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão a 100 x g por 1 min em um rotor de balde oscilante à temperatura ambiente. Usando uma pipeta de plástico, remova o sobrenadante MW que contém os espermatozoides de qualquer detrito de tecido grosseiro que terá peletizado nesta etapa.</li>
	<li>Levar o sobrenadante de MW contendo os espermatozoides a um volume total de 3 mL adicionando MW a 37 °C. Centrifugar a 400 x g durante 8 min (à temperatura ambiente) num tubo de fundo redondo. Remova lentamente o sobrenadante de MW dos espermatozoides soltos.</li>
	<li>Se viável, o espermatozoide deve aparecer como uma pelota de aparência "fofa". Ressuspenda suavemente os espermatozoides através da trituração com uma pipeta de transferência de furo grande ou através de toques manuais suaves no tubo ("toque do dedo"). Uma vez ressuspensos uniformemente, transfira-os para um novo tubo de fundo redondo. Use 10-20 μL da suspensão de espermatozoides para contar e avaliar a motilidade. Diluir os espermatozoides em MW para uso. NOTA: Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides de camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL MW é utilizada. O protocolo de imagem aqui descrito não requer a capacitação dos espermatozoides, embora seja necessário que os espermatozoides adquiram a capacidade de se submeter a exocitose acrossômica fisiologicamente relevante. Pode-se estudar exocitose patológica ou exocitose induzida através de reagentes como um ionóforo de cálcio sem capacitar os espermatozoides. Adicionalmente, pode-se explorar possíveis alterações no cálcio acrossomal em células não capacitadas em resposta a vários estímulos.</li>
	<li>Use os espermatozoides dentro de 3-5 h da coleta, mantendo o tempo o mais curto possível e consistente entre os ensaios experimentais.</li>
	<li>Realizar todas as etapas de coleta e lavagem a 37 °C utilizando meio MW, empregando métodos para minimizar os danos à membrana. Isso inclui o uso de pipetas de transferência de plástico de grande calibre ou pontas de pipeta de orifício grande, que são recomendadas para uso durante todas as etapas do procedimento.</li>
</ol>2. Revestimento poli-D-lisina de placas de deslizamento para imagem
NOTA: Pratos de poli-D-lisina (PDL) devem ser preparados frescos antes de cada experimento.
<ol><li>Dispense uma gota de PDL de 0,5 μL (0,5 mg/mL, ver Tabela de Materiais) no centro de uma placa de cobertura.</li>
	<li>Usando uma ponta graduada de 10 μL, esfregue a gota PDL através da lamínula (padrão cruzado como mostrado na Figura 1B).</li>
	<li>Deixe secar a 37 °C durante 10 min. Mantenha os pratos revestidos com PDL cobertos e a 37 °C até usar.</li>
</ol>3. Tração capilar, carregamento para puffing
<ol><li>Puxe os capilares de vidro borossilicato (O.D, 2 mm, I.D, 1,56 mm, consulte a Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações: Calor: 330, Puxar: 250, Velocidade: 250 e Tempo: 70. Esta etapa deve ser otimizada para o extrator específico em uso.</li>
	<li>Antes de cada experimento, carregar um único capilar com a solução estimulante contendo 3-5x a concentração do estimulante (para explicar a rápida difusão da solução ao puffing). Antes do enchimento, use uma pinça fina para abrir a ponta capilar a aproximadamente 1-2 mm da extremidade. Isso deve produzir um diâmetro de abertura de ∼5 μm. Não é necessário polimento térmico.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência de plástico fina, injete lentamente a solução estimulante no capilar até que três quartos de seu comprimento esteja cheio.</li>
	<li>Remova quaisquer bolhas de ar formadas durante o enchimento por meio de movimentos suaves do capilar.</li>
	<li>Monte capilar preenchido no micromanipulador (ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>4. Preparação da aplicação de estimulação para puffing
NOTA: Para minimizar o risco de lesão do usuário, óculos de segurança devem ser usados durante a operação do procedimento de puffing.
<ol><li>Configure as configurações do sistema de entrega de célula única para fornecer um pulso de 10 s a 5 psi.</li>
	<li>Conecte o capilar de borossilicato ao suporte da pipeta do sistema de entrega de célula única. Certifique-se de que as vedações estejam apertadas.</li>
	<li>Ao observar a ponta capilar, aplique um sopro curto de 2 s a 20 psi para garantir que a solução seja realmente dispensada através da extremidade da ponta (uma pequena gota deve ser óbvia no final da ponta).</li>
</ol>5. Microscopia e aquisição de imagens
NOTA: Várias marcas de microscópios estão disponíveis e podem ser usados; no entanto, uma taxa de quadros mínima de 3 quadros / s é desejável. Em relação à temperatura e ao controle ambiental, observe que a temperatura real do meio no prato deve ser confirmada, por exemplo, usando um termômetro infravermelho sem contato.
<ol><li>Adicionar 80 μL de esperma diluído ao centro de uma placa de cobertura de 35 mm revestida com poli-D-lisina. Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides em camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL é utilizada.</li>
	<li>Adicionar lentamente ao esperma 3 mL de meio base MW morno (37 °C) suplementado com CaCl2 10 mM. NOTA: Pode-se realizar experimentos à temperatura ambiente para retardar os processos celulares, mas é importante notar que, como a capacitação é mediada pelas trocas lipídicas e pela fluidez dos micro e macrodomínios, deve-se ter em mente que a capacitação fisiologicamente relevante e a exocitose acrossômica são processos dependentes da temperatura.</li>
	<li>Monte o prato com os espermatozoides no microscópio (pré-aquecido a 37 °C).</li>
	<li>Excite o GCaMP3 usando uma linha de laser de 488 nm e visualize com um filtro passa-banda (BP) de 505-550 nm. Excite o mCherry usando uma linha laser de 555 nm e visualize com um filtro BP de 575-615 nm.</li>
	<li>Usando um micromanipulador (recomenda-se fixar o manipulador à mesa de ar na qual o microscópio foi montado.), posicione a ponta do capilar aproximadamente 100 μm ao lado e 5-10 μm acima do plano da célula de interesse. NOTA: As soluções estimulantes são feitas a 3-5x a concentração normal para compensar a rápida difusão que ocorre no volume entre o capilar e a célula.</li>
	<li>Inicie a sequência de imagens no microscópio.</li>
	<li>Imagem de espermatozoides a uma alta taxa de quadros, de preferência >10 quadros/s. Aqui, foi utilizado um scanner ressonante que permite a obtenção de imagens a 33 ms/frame.</li>
	<li>Dez segundos após iniciar a aquisição da imagem ao microscópio, ative o sistema de liberação unicelular para iniciar o sopro de 10 s do estimulante.</li>
	<li>Células de imagem por uma duração de 10-15 min.</li>
	<li>Usando o sistema de liberação de célula única, imagine várias células de um único prato de acordo com os locais fornecidos na Figura 1B. NOTA: Os espermatozoides não tratados/não estimulados ao microscópio devem aparecer principalmente vermelhos, com baixa intensidade do sinal verde. As cabeças de espermatozoides devem ser presas à lamínula, e os espermatozoides vivos podem ser identificados por suas caudas em movimento. Nos espermatozoides que sofrem EA, o sinal verde GCaMP3 aumentará inicialmente, e tanto o sinal vermelho mCherry quanto o sinal verde GCaMP3 desaparecerão se o AE estiver completo, como ilustrado na Figura 2. A redução da fluorescência mCherry fornece um indicador mais específico do momento em que o AE começa, pois mudanças nas concentrações de Ca2+ causarão continuamente mudanças na intensidade da fluorescência GCaMP3.</li>
</ol>6. Análise de imagens e dados
NOTA: A análise de imagem off-line é realizada usando o ImageJ (consulte a Tabela de Materiais). Anteriormente, várias etapas intermediárias foram relatadas no processo que levou ao EA, incluindo elevação do cálcio acrossomal (RAC) e fusão completa da membrana. Este último leva à perda da fluorescência mCherry e, portanto, representa AE completo. Em algumas células, sinais semelhantes a eventos pré-pé de espícula (PSF) são observados ao usar abordagens amperométricas em estudos de exocitose (para mais detalhes, consulte2). Vários métodos opcionais estão disponíveis para analisar os dados brutos do AcroSensE para quantificar ACR, AE e suas etapas intermediárias. A seguir, descrevemos alguns dos métodos analíticos básicos.
<ol><li>Dependendo da extensão de arquivo do sistema do microscópio específico, use a ferramenta de canal dividido (Image > Colors > Split Channels) para gerar janelas individuais para os canais GCaMP3 e mCherry.</li>
	<li>Sincronize as janelas individuais usando a ferramenta "Sincronizar janela" (Analisar > Ferramentas > Sincronizar Windows).</li>
	<li>Selecione uma região de interesse (ROI) ao redor da cabeça do espermatozoide no canal vermelho para incluir a região acrossômica (Figura 3A,B). A ferramenta de sincronização permite que a mesma seleção de área seja aplicada automaticamente no canal verde, no qual os espermatozoides ainda estão muito escuros para serem visíveis.</li>
	<li>Escolha o plugin "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) ou "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) para plotar a mudança na intensidade da fluorescência em função de quadros/tempo para cada um dos dois canais.</li>
	<li>Copie os dados para um software de planilha (por exemplo, Microsoft Excel) para plotagem e análise adicional. Observação : uma vez que os dados são copiados para uma planilha, vários parâmetros podem ser extraídos para análise, incluindo o seguinte, conforme ilustrado na Figura 4.<ol><li>Tempo de início do Fusion Pore (FP): meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo em que o sinal GCaMP3 começa a subir. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta do ACR espermático.</li>
		<li>Hora de início AE: meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo onde o sinal mCherry começa a decair. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta espermática AE. Esse parâmetro também pode ser usado para calcular o atraso entre a formação do PF e a resposta do EA.</li>
		<li>Pico de amplitude de FP: mede o sinal de fluorescência da base até o pico de elevação do sinal GCaMP3. Esse parâmetro indica o aumento total na resposta do ACR.</li>
		<li>Taxa de perda de mCherry: determine este parâmetro por um ajuste linear ou exponencial na seção da perda do sinal mCherry (como indicado por "inclinação" na Figura 4B). NOTA: Alternativamente, determine a taxa de decaimento pelo método do sinal residual (R) em vários pontos de tempo (por exemplo, R60: tempo de duração em segundos para um sinal residual de 60% da linha de base do sinal mCherry). Esse parâmetro pode ser usado para quantificar a taxa de dispersão do conteúdo arossomal sobre EA.</li>
		<li>Diminuição do sinal para perda de mCherry: determine a diferença de amplitude entre a intensidade de fluorescência mCherry basal e o sinal após AE. Esse parâmetro indica a quantidade total de conteúdo acrossomal disperso sobre EA.</li>
		<li>Plotar as mudanças na fluorescência (F) para os canais vermelho e verde como dados brutos, ou normalizá-los pela fluorescência inicial (F0) e expressá-los como ΔF/F0. Este último fornece melhor visualização das mudanças em vermelho e verde em um único gráfico (por exemplo, veja a Figura 3D e a Figura 3H). NOTA: Finalmente, os diferentes parâmetros medidos podem ser comparados entre diferentes condições para determinar a relação entre mudanças na concentração de cálcio acrossomal e EA. Para exemplos de várias comparações de condições experimentais, ver referência2.</li>
	</ol></li>
</ol>

Combinando imagens com um sistema de entrega de estimulantes para estudar espermatozoides vivos de camundongos

<ol>
	<li>Austin, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+penetration+of+the+sperm+in+the+mammalian+egg.">Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg.</a> Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+sensor+reveals+spatial+and+temporal+dynamics+of+acrosomal+calcium+and+sperm+acrosome+exocytosis.">A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis.</a> J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).</li><li>Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+regulation+of+acrosome+exocytosis.">Lipid regulation of acrosome exocytosis.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).</li><li>Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+resolution+of+acrosomal+exocytosis+in+human+sperm.">Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm.</a> J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).</li><li>Sosa, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+human+sperm+acrosomal+exocytosis).">Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis).</a> Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).</li><li>Balestrini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+Current+methods+to+observe+sperm+acrosomal+exocytosis+in+real+time.">Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time.</a> Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).</li><li>Nakanishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+acrosomal+dispersal+from+mouse+sperm+using+GFP+as+a+marker+protein.">Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein.</a> FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).</li><li>Kim, K. S., Gerton, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+soluble+and+matrix+components:+evidence+for+intermediate+states+of+secretion+during+spontaneous+acrosomal+exocytosis+in+mouse+sperm.">Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm.</a> Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).</li><li>Hasuwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+sperm+that+have+green+acrosome+and+red+mitochondria+allow+visualization+of+sperm+and+their+acrosome+reaction+in+vivo.">Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo.</a> Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).</li><li>Henderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Low-Affinity+GCaMP3+Variant+(GCaMPer)+for+imaging+the+endoplasmic+reticulum+calcium+store.">A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store.</a> PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).</li><li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa.">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li><li>Cohen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+modulation+of+calcium+flux+through+CaV2.3+regulates+acrosome+exocytosis+and+fertilization.">Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization.</a> Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosome+reaction+and+Ca(2)(+)+imaging+in+single+human+spermatozoa:+new+regulatory+roles+of+[Ca(2)(+)]i.">Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i.</a> Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).</li></ol>

Não há conflitos de interesse a relatar relacionados a este trabalho.

Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias qu...

Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação1. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em 2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação4, são limitados à detecção da etapa final do EA (por exemplo, usando PNA5), são limitados a medidas de alterações no cálcio citosólico (em contraste com a dinâmica do cálcio acrossomal), ou limitam-se a medidas da dinâmica citosólica do cálcio ou AE6.
Para superar algumas das principais limitações dos estudos de EA em tempo real sob condições fisiológicas e permitir a investigação da interação entre a dinâmica do cálcio e EA, um modelo único de camundongo foi gerado. Neste modelo de camundongo, uma proteína de fusão composta pelo sensor Ca2+ codificado geneticamente (GCaMP3) e mCherry é expressa e direcionada para o acrossoma usando um promotor de acrosina e peptídeo de sinalização2. O sensor duplo GCaMP3-mCherry direcionado permite medições simultâneas em tempo real das concentrações de cálcio e do estado do conteúdo acrossomal em espermatozoides vivos em condições fisiológicas usando microscopia e um sistema de liberação de estimulante de célula única (Figura 1). Como componente da matriz acrisomal, a fusão da membrana e o AE resultariam na perda da fluorescência mCherry fotosestável e insensível ao pH do espermatozoide, uma vez que essa proteína se difunde para fora da vesícula do acrossoma. Nesse sentido, a capacidade do modelo de refletir o momento e a ocorrência de EA é semelhante aos benefícios da linhagem de camundongos GFP direcionada para acrossoma7,8,9.
A variante GCaMP3 usada nesta linha de camundongos transgênicos tem um KD aproximado de 400 μM e uma faixa dinâmica para Ca2+ de 10-4-10-3 M10, o que é adequado para esta vesícula. Mostramos que essa combinação de características da GCaMP3 poderia revelar a formação de poros de fusão entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa (MAO)2. A detecção de poros de fusão é resultado do tamanho dos poros ser muito pequeno para permitir que a proteína AcroSensE se disperse para fora do acrossoma (através da perda de conteúdo acrossomo) enquanto fornece um "canal" de membrana que permite o influxo de íons Ca2+ no lúmen acrossomo, levando a um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP3.
A proteína fluorescente brilhante, monomérica e não sensível ao cálcio mCherry suporta a visualização do acrossoma enquanto o sinal GCaMP3 é fraco (por exemplo, antes da ligação de Ca2+ , Figura 2) e, importante, também permite a identificação de espermatozoides intactos de acrossoma adequados para exames de imagem.
O protocolo a seguir descreve a utilização do modelo único de camundongos AcroSensE e os métodos de microscopia usados experimentalmente para estudar a dinâmica do cálcio espermático e AE com alta resolução espacial e temporal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x oil objective&#160;</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>UPlanApo,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm coverslip dish, 1.5 thickness</td>
			<td>MatTek Corp.&#160;</td>
			<td>P35G-1.5-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottomed tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capilarries</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>B200-156-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus Japan</td>
			<td>Olympus FluoView&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated tip&#160;</td>
			<td>TipOne, USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Cell Microscope Incubation Systems&#160;</td>
			<td>TOKAI HIT Shizuoka, Japan</td>
			<td>Model STX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co. CA USA</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette&#160;</td>
			<td>FisherBrand&#160;</td>
			<td>13-711-6M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell delivery system</td>
			<td>Parker, Hauppauge, NY</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of acrosomal calcium dynamics and exocytosis in live mouse sperm

A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico - o acrossoma espermático - e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.

Sperm acquire the ability to fertilize during a process called capacitation1. One endpoint of this process is that the sperm acquire the ability to undergo AE. Over two decades of data support the presence of a complex, multi-step model of AE in mammalian sperm (summarized in2,3). However, studying AE in live sperm is challenging, and currently available methods to monitor this process with adequate resolution are cumbersome and require multiple preparation steps4, are limited to the detection of the final step of AE (e.g., using PNA5), are limited to measurements of changes in cytosolic calcium (in contrast to acrosomal calcium dynamics), or are limited to measurements of either cytosolic calcium dynamics or AE6.
To overcome some of the key limitations of real-time AE studies under physiological conditions and to enable investigation of the interplay between calcium dynamics and AE, a unique mouse model was generated. In this mouse model, a fusion protein composed of the genetically encoded Ca2+-sensor (GCaMP3) and mCherry is expressed and targeted to the acrosome using an acrosin promoter and signaling peptide2. The targeted dual GCaMP3-mCherry sensor enables simultaneous real-time measurements of calcium concentrations and the status of the acrosomal contents in live sperm under physiological conditions using microscopy and a single-cell stimulant delivery system (Figure 1). As a component of the acrosomal matrix, membrane fusion, and AE would result in the loss of the photostable and pH-insensitive mCherry fluorescence from the sperm, as this protein diffuses out of the acrosome vesicle. In this regard, the model&#39;s ability to reflect the timing and occurrence of AE is akin to the benefits of the acrosome-targeted GFP mouse line7,8,9.
The GCaMP3 variant used in this transgenic mouse line has an approximate KD of 400 &#181;M and a dynamic range for Ca2+ of 10-4-10-3 M10, which is suitable for this vesicle. We showed that this combination of features of GCaMP3 could reveal fusion pore formation between the plasma membrane and the outer acrosomal membrane (OAM)2. The fusion pore detection is a result of the pore size being too small to allow the AcroSensE protein to disperse out of the acrosome (via loss of acrosome content) while providing a membrane &#34;channel&#34; that enables the influx of Ca2+ ions into the acrosome lumen, leading to an increase in fluorescence intensity of the GCaMP3.
The bright, monomeric, non-calcium-sensitive fluorescent protein mCherry supports visualization of the acrosome while the GCaMP3 signal is faint (e.g., prior to Ca2+ binding, Figure 2), and importantly, it also allows for the identification of acrosome-intact sperm cells suitable for imaging.
The following protocol describes the utilization of the unique AcroSensE mouse model and the methods for microscopy used experimentally to study AE and sperm calcium dynamics with high spatial and temporal resolution.

Autor em destaque: uma técnica de imagem de células vivas para estudar a sinalização de cálcio e exocitose acrossômica em espermatozoides de camundongos 

Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Our research goal is to better understand the molecular mechanisms that regulate sperm function, including the processes such as capacitation and fertilization. Specifically, we're exploring how membrane lipids activate calcium signaling and acrosome exocytosis. This protocol addresses the gap in our understanding of the interplay between capacitation, sperm activation, calcium signaling, and acrosome exocytosis.The advantages of this protocol include imaging sperm under physiological conditions, as well as its ability to simultaneously monitor both calcium signaling and acrosome exocytosis without the need for complicated preloading or standing procedures.

A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência a...

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O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process ...

Nosso objetivo de pesquisa é entender melhor os mecanismos moleculares que regulam a função espermática, incluindo os processos como capacitação e fecundação. Especificamente, estamos explorando como os lipídios da membrana ativam a sinalização de cálcio e a exocitose acrossomal. Este protocolo aborda a lacuna em nossa compreensão da interação entre capacitação, ativação espermática, sinalização de cálcio e exocitose acrossomal.As vantagens deste protocolo incluem a obtenção de imagens de espermatozoides em condições fisiológicas, bem como sua capacidade de monitorar simultaneamente a sinalização de cálcio e a exocitose acrossômica sem a necessidade de procedimentos complicados de pré-carregamento ou em pé.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm

681 visualizações.  Cornell University. Nosso objetivo de pesquisa é entender melhor os mecanismos moleculares que regulam a função espermática, incluindo os processos como capacitação e fecundação. Especificamente, estamos explorando como os lipídios da membrana ativam a sinalização de cálcio e a exocitose acrossomal. Este protocolo aborda a lacuna em nossa compreensão da interação entre capacitação, ativação espermática, sinalização de cálcio e exocitose acrossomal.As vantagens deste protocolo inclue...

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Acrosome exocytosis (AE), in which the sperm&#39;s single exocytotic vesicle fuses with the plasma membrane, is a complex, calcium-dependent process essential for fertilization. However, our understanding of how calcium signaling regulates AE is still incomplete. In particular, the interplay between intra-acrosomal calcium dynamics and the intermediate steps leading to AE is not well-defined. Here, we describe a method that provides spatial and temporal insights into acrosomal calcium dynamics and their relationship to membrane fusion and subsequent exocytosis of the acrosome vesicle. The method utilizes a novel transgenic mouse expressing an Acrosome-targeted Sensor for Exocytosis (AcroSensE). The sensor combines a genetically encoded calcium indicator (GCaMP) fused with mCherry. This fusion protein was specifically designed to enable the concurrent observation of acrosomal calcium dynamics and membrane fusion events. Real-time monitoring of acrosomal calcium dynamics and AE in live AcroSensE sperm is achieved using a combination of high frame-rate imaging and a stimulant delivery system that can target single sperm. This protocol also provides several examples of basic methods to quantify and analyze the raw data. Because the AcroSensE model is genetically encoded, its scientific significance can be augmented by using readily available genetic tools, such as crossbreeding with other mouse genetic models or gene-editing (CRISPR) based methods. With this strategy, the roles of additional signaling pathways in sperm capacitation and fertilization can be resolved. In summary, the method described here provides a convenient and effective tool to study calcium dynamics in a specific subcellular compartment-the sperm acrosome-and how those dynamics regulate the intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

The AcroSensE mouse model and live cell imaging methods described here provide a new approach to studying calcium dynamics in the subcellular compartment of the sperm acrosome and how they regulate intermediate steps leading to membrane fusion and acrosome exocytosis.

Biologia do Desenvolvimento

Collection and Washing of Sperm from the AcroSensE Mouse Model for Real-Time Imaging

Begin by collecting sperm from the cota epididymus, isolated from a transgenic model mouse expressing AcroSensE. Perform the sperm collection in a 3.5 centimeter tissue culture dish containing 0.5 milliliters of MW medium by allowing a 15 minute swim out procedure at 37 degrees Celsius. Then using fine forceps, carefully remove any epididymal tissue from the swim out collection dish.Transfer the medium containing the sperm into a 15 milliliter conical tube and using a swinging bucket rotor centrifuge the suspension at 100 G for one minute at room temperature. With the help of a plastic pipette, collect the MW supernatant containing the sperm while discarding any pellet of gross tissue debris and transfer it to a round bottom tube. Adjust the supernatant volume to one milliliter by adding 500 microliters of MW medium prewarmed to 37 degrees Celsius.Centrifuge this mixture at 400 G for eight minutes at room temperature in a round bottom tube. Then carefully remove the supernatant while leaving behind the loosely pelleted sperm. Using a large bore transfer pipe, re-suspend the sperm by gently tapping the tube manually known as finger flicking.Once the sperm are evenly re-suspended, transfer them into a new round bottom tube.

Coleta e Lavagem de Espermatozoides do Modelo de Camundongo AcroSensE para Imagem em Tempo Real

Setting up the Single Cell Stimulant Delivery System for Real-Time Monitoring of Live Mouse Sperm

To begin, pull borosilicate glass capillaries with an outer diameter of two millimeters and an inner diameter of 1.56 millimeters, following appropriate settings. Prior to filling the capillary before each experiment, use fine tweezers to break open the tip of the capillary. For loading the capillary, use the stimulating solution at three to five times the normal concentration of the stimulant required.With a thin plastic transfer pipette, slowly inject the stimulating solution into the capillary until 3/4 of its length is filled. Eliminate any air bubbles that may form during the filling process by gently flicking the capillary. Then, mount the filled capillary on the micromanipulator.Configure the single cell delivery system settings to provide a 10-second pulse at five psi. Connect the borosilicate capillary mounted on the micromanipulator to the single cell delivery system pipette holder. Apply a brief puff lasting two seconds at a pressure of 20 psi, while observing the capillary tip to confirm that the solution is being dispensed through the tip's end.The setup is now ready for use with microscopy for real-time imaging of a single mouse sperm.

Configurando o Sistema de Entrega de Estimulante de Célula Única para Monitoramento em Tempo Real de Espermatozoides Vivos de Camundongos

Combining Microscopy with a Stimulant Delivery System to Monitor Live Sperm from an AcroSensE Model Mouse

Begin by coating the 35-millimeter coverslip dishes with Poly-D-Lysine, or PDL. To do so, dispense a 0.5 microliter droplet of PDL at the center of a coverslip dish. Using a 10-microliter graduated pipette, smear the PDL droplet across the coverslip.Allow the coated coverslip dish to dry at 37 degrees Celsius for 10 minutes. For imaging the freshly collected sperm from a mouse model expressing AcroSensE, add 80 microliters of the prepared sperm suspension to the center of the PDL-coated coverslip dish. Then, slowly add three milliliters of supplemented, modified Whitten's base media pre-warmed to 37 degrees Celsius to the dish.Proceed to perform the imaging using a combination of a microscope with the single cell stimulant delivery setup. First, mount the dish containing the sperm on the microscope. Then, using the micromanipulator, position the capillary tip of the stimulant delivery system about 100 microns to the side and five to 10 microns above the plane of the cell of interest.Position the capillary within 100 microns from the sperm head. Next, start the imaging sequence on the microscope. Image sperm cells at a high frame rate, preferably greater than 10 frames per second.10 seconds after initiating the image acquisition, activate the single cell delivery system to deliver a 10-second puff of stimulant. Continue capturing images of cells for a duration of 10 to 15 minutes. In a similar manner, image multiple cells from a single dish according to the locations shown on the screen.