Este trabalho é financiado pelo Wellcome Trust, The Medical Research Council, The Royal Society, Ciência Birmingham City e The Research Trust Infertilidade. Gostaríamos de agradecer o apoio de especialistas de Pesquisa Cairn em construção e integração dos equipamentos de imagem.

Esperma de homens saudáveis ​​fértil, com uma análise do sêmen normal, são normalmente preparadas para imagens como se segue. <ol><li> Amostras de sêmen são armazenadas a 37 ° C por não mais de 30 min. Células são isoladas do plasma seminal de nadar até em complementada solução salina de Earle equilibrada (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glicose, 2,73 piruvato Na, 41,8 lactato Na) suplementado com 0,3% de carvão de-lipidated/fatty ácido livre Fraction V BSA (qualidade da BSA é crucial para o sucesso da capacitação espermática). 1 ml de sEBBS é pipetado em cada um de uma série de 5 tubos de ml e gentilmente underlayered com 0,3 ml de sêmen. Após a incubação por 1 hora (37 ° C; 6% CO 2) a 0,7 ml de topo é suavemente retirada de cada tubo e agrupados. 10 ml da suspensão de espermatozóides é diluído com 90 mL de 1% (v / v) de formol para imobilizar as células, então, os espermatozóides são contados em câmara de Neubauer. Densidade de células na suspensão é então ajustada (com sEBSS) a 6 milhões de células / ml. </li><li> A amostra é então dividido em alíquotas de 200 mL em tubos fracamente cobertas e incubadas (37 ° C; 6% CO 2) por 5-6, em h para permitir a capacitação. </li><li> Lamelas (22x50 mm) foram previamente tratadas com poli-D-lisina. 10 ml de poli-D-lisina solução (10% w / v) é aplicado como um número de gotas pequenas para o centro da lamela. O poli-D-lisina é então permitido secar ao ar. Isto pode ser em um palco e deve ser aquecida até à dessecação completa. A lamela é anexado com graxa de vácuo para um fechado, purpose-built, perfusable, policarbonato imagem câmara (dimensões 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacidade de ≈ 180 mL). Semelhantes à câmara RC20 Warner O poli-D-lisina lamela revestido forma a base da câmara quando as células são visualizadas em um microscópio invertido e 12 mm de diâmetro circular lamela forma a superfície superior da câmara, permitindo a transmissão de luz. </li><li> Oregon Verde BAPTA1-AM (OGB) ou cálcio Verde 1-AM são usados ​​para as células de rotulagem. OGB é preparada pela dissolução em DMSO. PLURONIC ácido F127 (detergente) está incluído no DMSO para evitar &quot;aglomeração&quot; do corante. Isto pode ser preparado em laboratório (100 PLURONIC mg em 0,5 ml DMSO), imediatamente antes do uso, ou pode ser adquirido pré-preparados. 20 l é adicionado a uma alíquota de 50 mg de OGB (2,5 mg / ml). O frasco pode ser conservado congelado e descongelado para uso posterior. </li><li> Após a capacitação dos espermatozóides (5-6 h em sEBBS, 37 ° C; 6% CO 2) de um tubo é selecionado para imagens e 1,2 ml de solução OGB é adicionado, dando uma concentração final de 10 mM. O tubo é então incubada por 40 min mais um, após o qual a suspensão celular é suavemente injetada na porta de entrada da câmara de imagem com um p1000 ponta da pipeta (azul). A câmara é colocada no lado lamela incubadora, poli-D-lisina-revestido para baixo, por 20 min. Células tendem a nadar ao longo das superfícies da câmara e vai aderir ao espaço poli-D-lisina-revestido. </li><li> A câmara está montada no microscópio, conectado ao aparelho de perfusão e perfundidos em min aproximadamente 0,5 ml /. A bomba de roletes alimenta salina na câmara e estouro da porta de saída é removido por uma bomba de sucção com armadilha. A preparação é deixado no escuro por pelo menos 10 min, enquanto as células soltas e corante extracelular são removidos por perfusão da câmara. Estabilidade de temperatura é crucialmente importante porque pequenas flutuações podem não afetam apenas células Ca 2 + homeostase, mas também pode afetar K d do corante. Experimentos são normalmente realizadas a 25 ° C, alcançado por manter a temperatura da sala escura, a este nível. Nós descobrimos que a manutenção da temperatura ambiente no nível exigido proporciona maior estabilidade de temperatura e foco do que usar um estágio de temperatura controlada ou um aquecedor controlado termostaticamente sobre o fluxo de solução salina. </li><li> Células são vistas sob contraste de fase (40x ou 60x de imersão em óleo) objetivas e uma área para a imagem é selecionada. A parte da área poli-D-lisina revestido que está perto da porta de entrada é a preferida, onde o fluxo de solução salina é laminar e consistente. Também é importante o uso de uma área onde a densidade celular é apropriado (densidade excessiva afeta a qualidade e integridade de dados através da captação de sinal a partir de células adjacentes) e onde as células estão devidamente ligados mas a atividade flagelar é discernível. Uma imagem de contraste de fase é salvo. O microscópio é então ligado ao modo de fluorescência (excitação 480 nm; nm de emissão 540) e tempo de exposição é reduzido ao mínimo necessário para obter uma imagem clara de fluorescência (geralmente 5-20 ms). </li><li> O experimento é iniciado pela ativação da série de tempo software de aquisição de imagem (IQ). Geralmente as imagens são adquiridas a 0,1 Hz e iluminação é restrita aos períodos de aquisição de imagens usando apenas um software obturador controlado. Taxas de aquisição muito maior imagem pode ser usada mas tendo em conta deve ser feita para problemas de branqueamento e geração de artefatos devido a foto de danos às células (ver discussão). IQ (e mais outras plataformas de software de aquisição) permitirá em tempo real de gráficos de fluorescência durante o experimento. </li><li> Após um período de controle de 3-5 minutos de duração manipulação de constituintes salina (como [Ca 2 +] o) e aplicação de drogas é conseguido através da substituição de soro fisiológico no cabeçalho de perfusão. Tempo de adição de cada estímulo é anotado para que o tempo de chegada na câmara de imagem pode ser calculada, fornecendo uma precisão suficiente para a avaliação das respostas lentas descrito aqui (amostrado a 0,1 Hz). Para respostas mais rápidas maior precisão pode ser obtida pela adição de estímulos diretamente para o fluxo de soro fisiológico através de uma porta entrada segundo, tal como previsto no RC20 Warner câmara. </li><li> As imagens são analisados ​​off-line usando QI. Regiões de interesse (ROIs) são desenhados em volta de cada célula (ou parte da célula) e também uma área livre da pilha é selecionado (por subtração de fundo automática pelo software. A série de imagens é então verificado para remover as células que morreram ou foram submetidos a reação acrossômica ( que aparece como um aumento considerável e rápido de fluorescência seguidos de perda de corante citoplasmático) durante o experimento e as que mostraram movimento suficiente para causar artefatos quando analisada como uma série temporal. </li><li> Uma série de intensidade de fluorescência de tempo é, então, obtidos para cada ROI e esses dados são analisados ​​off-line no Excel. Inicialmente fluorescência é normalizado para o valor médio obtido durante o período de controle, usando a equação R = [(resto FF) / F resto] x 100%, onde R é a mudança de fluorescência% em comparação com o período de controle, F é a intensidade de fluorescência no tempo t e descansar F é a média de pelo menos 30 determinações de F obtidos durante o período de controle. </li></ol> Resultados representante A Figura 1 mostra uma série de imagens a partir de um experimento no qual as células foram estimuladas com 3 mM progesterona. A linha superior e um filme de mostrar as imagens de fluorescência em escala de cinza e os magos mesmo são mostrados abaixo (e no filme 2) no pseudo (lookup &#39;16_colors tabela &#39;em Image J), ​​onde&#39; cool &#39;cores indicam a intensidade fluorescente de baixa e &quot;quente&quot; cores indicam alta intensidade de fluorescência. As células podem ser visualizadas em pseudo durante o experimento, utilizando tabelas de pesquisa de QI, mas usando escala de cinza é geralmente mais informativa para avaliar. Se as células estão bem marcadas. As duas primeiras imagens foram coletadas em 0 s e 100 s após o início da gravação. Fluorescência deve ser estável e tende a ser mais forte na área de pós-acrossomal e pescoço esperma. Progesterona entrou na câmara de imagens em aproximadamente 175 s e 3 ª e 4 ª imagens (180 e 220 ​​s s) mostra um rápido aumento na [Ca 2 +] i (fluorescência), originários da cabeça e pescoço posterior da célula. Imagens seguintes são de 290, 360, 740, 990 e 1440 s, mostrando a decadência da inicial [Ca 2 +] i transitória e desenvolvimento de uma elevação sustentada secundário. A Figura 2 mostra uma análise de planilhas, convertendo-prima valores de fluorescência para cada ROI de fluorescência normalizados (% de mudança de fluorescência em comparação com o período de controle) A Figura 3 mostra-tempo normalizado parcelas de fluorescência por 3 células mostrando &quot;típico&quot; respostas a 3 mM progesterona. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Exemplo de dados de uma célula estimulada com progesterona. Uma série de imagens de fluorescência em tons de cinza (linha superior) e pseudo (linha inferior) são mostrados. Pontos no tempo são de 0, 180, 220, 290, 360 e 990s. 3 progesterona mM entrou na câmara de imagens a 175 s. ROIs são mostrados no primeiro painel. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análise de dados única célula de fluorescência em Excel. Números em preto são séries temporais de dados de fluorescência, dispostos verticalmente. Números em vermelho (abaixo) são dados normalizados obtidos pela equação dada no texto. Gráfico mostra enredo fluorescência tempo normalizado para 64 celulares neste experimento que, com a estimulação, mostra uma elevação transitória na fluorescência seguido por um crescimento lento e uma série de pequenas oscilações. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Fluorescência em tempo vestígios de três células individuais, expressa como alteração% em relação ao controle de valor .. 3 progesterona mM foi adicionado no momento marcado pela seta. Mostra linha tracejada significa fluorescência de controle.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Quando realizados com sucesso, esta técnica permite a gravação da distribuição e da cinética de espontânea e induzida por Ca 2 + sinais no esperma humano. Respostas podem ser obtidas a partir de um grande número de células (até 200), que é importante, pois o esperma humano pode mostrar uma grande variação na sua espontânea e estimulada Ca 2 + sinais. Rotulagem de sucesso e sobrevivência das células durante a gravação são altamente dependentes da qualidade da amostra. Amostras pobres dão rotulagem pobres, as respostas pobres e as células podem morrer durante a gravação. Esperma humano são muito sensíveis a danos foto-e, portanto, use a iluminação mínima necessária (tanto a intensidade e tempo de exposição), a fim de maximizar a sobrevivência da célula e minimizar artefatos devido à morte celular. Uma câmera de alta sensibilidade (permitindo uso de iluminação de baixa intensidade) é um grande benefício já que a câmera vai pegar fluorescência fraca. Retro-iluminado, EM-câmeras CCD são particularmente bem adequada, embora muito caro. Iluminação de LED (em vez de usar uma lâmpada de mercúrio ou de xenônio com filtro de excitação também melhora a sobrevivência da célula (Nishigaki et al, 2006). Nós não usamos Fura-2, apesar das vantagens óbvias de relação de métricas de imagem, porque Fura requer excitação com luz UV e porque é necessário tomar duas imagens para cada relação. Para os dados obtidos com único comprimento de onda, corantes luz visível, a normalização da intensidade de fluorescência compensa largamente diferença no carregamento de corante entre as células, mas não para distribuição de tinta dentro de uma cela individual, e isso deve-se ter em mente. Apesar de corantes único comprimento de onda pode, em princípio, ser calibrado, a precisão da técnica é pobre e não tentar fazer isso. Considerando que os dados obtidos com relação Fura-2 (ou a emissão de relação de corante indo), mesmo sem calibração, dar uma representação fiel aceitável de mudanças relativas de [Ca 2 +] i, a intensidade de fluorescência dos corantes único comprimento de onda está longe de ser linear relacionados com a [Ca 2 +] i. Sobre a parte mais útil da curva de saturação a relação de corantes único comprimento de onda é normalmente próximo a logarítmica. Atualmente usamos Oregon Verde BAPTA-1 (Figura 4), ​​porque ele é sensível a pequenas alterações na [Ca 2 +] i perto de descanso nível s (5-10 nM). Quando [Ca 2 +] i sobe acima de 1 mM respostas serão sub-representados em termos de mudança de fluorescência ea tintura pode saturar. Uma opção para aprimoramento da técnica, sem recorrer a excitação UV é dobrar células de carga com um corante como Fluo-3 e vermelho Fura. Ambos podem ser animado a 488 nm, mas simultânea suas respostas são muito diferentes. Gravação de emissão a 540 e 650 nM fornece uma relação que pode fornecer um método melhor para o monitoramento preciso de [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) e pode ser aplicável ao esperma (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Relação entre livre [Ca 2 +] (nm) e emissão de fluorescência no pico de comprimento de onda (nm aproximadamente 525) Oregon Verde BAPTA-1 e Verde Oregon BAPTA-2. OGB1 dá uma maior fluorescência em repouso [Ca 2 +], mas satura em níveis mais baixos e, portanto, tem um intervalo menor utilizável. Dados para essas parcelas foram obtidos a partir da Molecular Probes manual (Haughland, 2002).

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

Microscopia de fluorescência de células carregadas com fluorescentes, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensíveis corantes é utilizado para a medição de aspectos espaciais e temporais de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinalização em células vivas. Aqui nós descrevemos o método utilizado em nossos laboratórios para carregar suspensões de esperma humano com Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Corantes de relatórios e medição do sinal de fluorescência durante a estimulação fisiológica. Células móveis são isolados por direta swim-up e incubados em condições de capacitação para 0-24 h, dependendo do experimento. A célula-permeante AM forma de éster (acetoxi éster metílico) do Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; De relatórios corante é então adicionado a uma alíquota de células e um período de 1 h é permitido para a carga do corante para o citoplasma. Nós usamos corantes comprimento de onda visível para minimizar danos foto-para as células, mas isso significa que a gravação raciométrica não é possível. Vantagens e desvantagens desta abordagem são discutidos. Durante o período de células de carga são introduzidos em uma câmara de imagem e permitiu a aderir a uma lamela poli-D-lisina revestido. No final do corante de carregamento período de excesso de células soltas e são removidos por conexão da câmara ao aparelho de perfusão. A câmara é perfundido continuamente, estímulos e salinas modificados são então adicionado ao cabeçalho de perfusão. Experimentos são registradas por lapso de tempo de aquisição de imagens de fluorescência e analisados ​​em off-line detalhe, por manualmente desenho regiões de interesse. Dados são normalizados para pré-estímulo níveis tais que, para cada célula (ou parte de uma célula), um gráfico mostrando o Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Resposta como a mudança% na fluorescência é obtido.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Estímulo evocado [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais] i de espermatozóides humanos individuais são avaliados. Células móveis são carregados com Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensíveis ao corante fluorescente (AM-éster de método) e imobilizada em uma câmara perfusable. Células são gravadas por lapso de tempo de microscopia de fluorescência e estimulado através do meio de perfusão. Respostas de células individuais (ou regiões) são analisados ​​off-line usando o Excel.

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K visualizações.  University of Birmingham. Estímulo evocado [Ca 2 + Sinais] i de espermatozóides humanos individuais são avaliados. Células móveis são carregados com Ca 2 + Sensíveis ao corante fluorescente (AM-éster de método) e imobilizada em uma câmara perfusable. Células são gravadas por lapso de tempo de microscopia de fluorescência e estimulado através do meio de perfusão. Respostas de células individuais (ou regiões) são analisados ​​off-line usando o ...

Vídeo: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imagem de Neurônios Corpo Mushroom durante o aprendizado olfativo no Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...