우리의 assays는 인간 적인 정자 세포 기능에 그들의 효과 대 한 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 이러한 방법은 인간 정자 세포에서 칼슘 신호 및 곡예 반응에 미치는 영향에 대한 많은 화합물을 빠르고 쉽게 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모를 사용하면 다른 사용자가 자신의 실험실에서 유사한 실험을 쉽게 설정할 수 있습니다.
먼저 원시 정액 샘플 1밀리리터당 50밀리리터 튜브를 45도 각도로 튜브 랙에 넣고 각 튜브에 섭씨 37도의 인간 투비액 또는 HTF 양성 배지의 4밀리리터를 추가하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 각 튜브의 바닥에 액화 정액 샘플 1 밀리리터를 조심스럽게 피펫하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 45도 각도로 유지되는 수정된 파이펫 팁을 사용하여 HTF 양성 배지를 함유하는 운동성 정자 세포의 상부 부분을 새로운 15 밀리리터 플라스틱 튜브로 부드럽게 전달합니다.
수집된 정자 세포를 계산하기 위해, 예상 농도에 따라 라운드 하단 2 밀리리터 튜브에서 S100 완충체에서 20 마이크로리터 알리쿼트를 10, 20, 30, 50 또는 90의 계수로 희석한다. 분당 700 회전에서 10 초 동안 희석 된 정자 세포를 소용돌이. 다음으로, SP1 카세트를 샘플에 담그고 흰색 플런저를 완전히 우울하여 샘플의 알리쿼트를 카세트에 흡인시합니다.
그런 다음 카세트를 영상 세포계 트레이에 놓고 적용된 희석계에 따라 PI 염색된 인간 정자 세포 분석법을 실행한다. 무료 세포내 칼슘 농도의 변화를 측정하기 위해 정자 샘플을 한 번 위아래로 부드럽게 피펫하고 자동 리피터 파이펫을 사용하여 불소 소로페스테드 정자 세포의 50 마이크로 리터를 384 마이크로 웰 플레이트의 1 열 24 우물로 알리쿼트합니다. 형광판 판독기에 마이크로 웰 플레이트를 섭씨 30도에 놓고 형광소에 적합한 프로토콜을 선택합니다.
정자 세포의 행에서 잘 선택하고 20 %의 목표 값으로 게인을 조정한 다음 측정을 시작합니다. 10개의 기준선 주기 후에 실험을 일시 중지하고 마이크로 웰 플레이트로 서랍을 배출합니다. 12 채널 파이펫을 사용하여, 신속하게 12 개의 중복 우물에 화합물 및 관심 제어의 준비 된 솔루션의 25 마이크로 리터를 추가하고 즉시 판독기에게 플레이트를 반환하여 가능한 한 빨리 측정을 계속합니다.
화합물 또는 컨트롤의 첨가에 대한 응답으로 형광의 모든 변화는 기기에 의해 포착됩니다. 곡예 반응 분석을 위해, 적절한 형광 염료, 화합물 또는 컨트롤로 커패시티드 정자 세포를 배양 한 후, 파이프팅하여 샘플을 혼합하고 고정 용액의 100 마이크로 리터에 각 테스트 샘플의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 샘플을 다시 혼합하고 챔버 당 샘플의 약 30 마이크로 리터와 샘플 당 하나의 A2 슬라이드의 챔버를로드합니다.
그런 다음 첫 번째 로드된 슬라이드를 이미지 사이토미터의 트레이에 놓습니다. FlexiCyte 프로토콜을 선택하고 실행을 누릅니다. 여기서 는 4개의 화합물의 효과를 시험하는 실험에서 대표적인 결과를, 양성 프로게스테론 제어 및 배지 처리량 칼슘 신호 분석서를 이용한 음의 완충제어가 입증된 바와 같이 관찰될 수 있다.
본 그래프에서, 프로게스테론의 연속희석 농도에 의해 유도된 세포내 자유 칼슘 농도의 피크 퍼센트 변화로부터 유래된 프로게스테론의 투여반응 곡선이 나타난다. 이 데이터는 중간 처리량 곡자 곡자 반응 분석에서 커패시케이트 된 인간 정자 세포에 있는 곡어 반응의 유도에 1개의 부정적인 또는 2개의 긍정적인 통제의 1개의 효력을 보여줍니다. 유도된 신호의 피크를 놓치지 않으려면 복제 우물에 화학 물질을 신속하게 추가하고 그 후 즉시 측정을 계속하는 것이 중요합니다.
형광과 염료의 유형을 변경함으로써, 우리의 연구는 쉽게 다른 과학적 질문에 대답하기 위해 수정 할 수 있습니다. 이러한 assays이미 인간의 정자 기능에 그들의 효과 대 한 화합물의 큰 그룹을 테스트 하는 여러 연구에서 사용 되었습니다.
