Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Estes ensaios podem ser usados para avaliar e comparar saídas imunológicas de diferentes genótipos vegetais. A principal vantagem dessas técnicas é que elas são rápidas, confiáveis e usam equipamentos de laboratório comuns. Para o ensaio de inibição do crescimento, as mudas do mesmo tamanho e idade devem ser transplantadas e totalmente borradas secas antes de pesar para limitar a variação.

Em quatro a cinco semanas após a germinação, use um soco de biópsia de quatro milímetros para remover um disco de folha por planta arabidopse, evitando a midveina e tomando cuidado para limitar a ferida. Colete os discos em poços individuais de uma placa luminômetro nãoutilada contendo 100 microliters de água duplamente destilada por poço, lado adaxial para cima, para evitar a dessecação. Se avaliar vários elicitors, remova um segundo disco de folha da mesma folha para cada tratamento elicitor e cubra a placa com a tampa para permitir que os discos da folha se recuperem durante a noite à temperatura ambiente.

Na manhã seguinte, defina os parâmetros do leitor de microplapes para um tempo de integração de 1.000 milissegundos em intervalos de dois minutos durante um período de 40 a 60 minutos para capturar a explosão oxidativa dinâmica. Em seguida, use uma pipeta multicanal para substituir a água em cada poço por 100 microliters de solução de reação recém-preparada, incluindo um controle, nenhuma reação elicitor para cada genótipo para avaliar os níveis de espécies de oxigênio de reação basal na ausência de provocação. Em seguida, meça imediatamente a emissão de luz para todos os comprimentos de onda no espectro visível no leitor de microplaca.

Aos quatro dias pós-germinação, carregue cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microliters de MS médio suplementado com uma diluição de peptídeo elicitor. Em seguida, use fórceps estéreis para transplantar cuidadosamente seis a oito mudas do mesmo tamanho, idade e genótipo para cada diluição de peptídeos, tomando cuidado para que não haja danos à muda ou quebra da raiz e que a raiz esteja submersa em meio. Quando todas as mudas tiverem sido banhadas, sele as placas com fita micropora e coloque as plantas em condições padrão de curto-dia por oito a 12 dias.

Para determinar a inibição percentual de crescimento, tire uma foto para registrar visualmente a inibição do crescimento antes de remover cuidadosamente as mudas de cada poço. Em seguida, descarar as raízes em uma toalha de papel para secar, e pesar cada muda em uma escala analítica. Neste experimento representativo, plantas mutantes com sinalização imune hiperativa demonstraram uma maior explosão oxidativa acumulada e média em comparação com plantas arabidopsis do tipo selvagem, enquanto plantas mutantes com sinalização imunológica prejudicada apresentaram uma explosão oxidativa reduzida em concentrações entre 10 e 1.000 nanomolar.

Diferenças esperadas na inibição do crescimento das mudas também podem ser discernidas entre todos os genótipos cultivados em 100 e 1.000 concentrações de peptídeos nanomolares. Quando cultivados na diluição de peptídeos nanomolar de 1.000, os mutantes com sinalização imunológica hiperativa eram notavelmente menores do que as plantas do tipo selvagem cultivadas sob as mesmas condições, enquanto os mutantes com sinalização imunológica prejudicada exibiam uma fraca inibição do crescimento em relação às plantas do tipo selvagem. Esses métodos fornecem evidências de respostas imunes precoces e tardias.

Várias outras técnicas, incluindo ensaios de quinase MAP, expressão genética induzida por patógenos e ensaios de infecção, podem ser usadas para delinear essas vias. Estas técnicas foram modificadas para uso em telas de grande escala, que identificaram com sucesso proteínas receptoras de patógenos e vários outros componentes de sinalização.