A drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui apresentamos um protocolo para medir a atividade de sinthase citrato em tecido homogeneado de moscas adultas. Este protocolo não requer isolamento das mitocôndrias.
É rápido e simples e é adequado para medir a atividade de sinthase citrato em larvas, células cultivadas e tecidos mamíferos. Comece coletando moscas adultas para cada amostra, certificando-se de coletar pelo menos amostras triplicadas para cada genótipo. Prepare 500 microliters de tampão de extração gelada com HEPES de 20 mililitros, um EDTA mililitro e 0,1% tritão X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro para cada amostra.
Anestesiar as moscas adultas com dióxido de carbono em uma almofada de anestesia. Para isolar os tóraxs, fixá-los com um par de fórceps e isolar os abdômens de mosca cortando ao longo da borda do tórax e abdômen com uma tesoura. Colete os tóraxs de mosca para o ensaio de atividade de sinthase citrato.
Transfira 10 tóraxs de mosca adultos para 100 microliters de tampão de extração gelada imediatamente e homogeneize-os com um pilão no gelo. Mantenha as amostras frias homogeneizando por cinco a 10 segundos no gelo, deixando-as sentar no gelo por cinco segundos, repetindo-as até que todos os tecidos sejam completamente homogeneizados. Alíquota 10 microliters de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de teor de proteínas, mantendo esses tubos no gelo também.
Adicione 400 microliters de tampão de extração gelada a cada amostra restante para um volume total de 500 microliters e pipeta para cima e para baixo suavemente para misturar. Para cada reação, adicione um microliter de diluído lysato celular a 150 microliters da solução de reação recém-preparada. Misture bem afim por tubos suavemente, certificando-se de evitar a formação de bolhas, em seguida, use um leitor de placas para medir a absorvância em 412 nanômetros a cada 10 a 30 segundos durante quatro minutos a 25 graus Celsius.
Plote os dados como absorvância ao longo do tempo e, em seguida, calcule a inclinação para a porção linear da curva. Por fim, divida a taxa de reação ou inclinação pela concentração de proteínas amostrais para normalizar a atividade de sinthase citrato. Foi hipótese de que o knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumentaria a atividade de sintetizador mitocondrial enquanto o knockdown de dPGC-1 reverteria esse aumento.
Estabeleceu-se uma taxa enzimática linear inicial para cada ensaio;as inclinações das linhas de tendência representam as taxas de reação máxima que são equivalentes às atividades de sinthase citrato maximal dos diferentes genótipos. As atividades máximas de sinthase citrato foram calculadas a partir das curvas cinéticas e normalizadas pela concentração proteica. Os resultados demonstraram que a atividade de synthase dos tóraxes-mosca realmente aumentou com o knockdown dRNF34 específico do músculo e o aumento foi revertido por knockdown dPGC-1 específico para músculos.
Ao homogeneizar a amostra, é importante virar o tubo e verificar o homogeneizado para ter certeza de que não há coágulos e que os tecidos do tubo estão completamente homogeneizados. Após a coleta da amostra, todos os tratamentos amostrais devem ser realizados no gelo. O ensaio de atividade de sinthase citrato é usado para quantificar massa mitocondrial intacta.
A quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial.
