Nosso protocolo permite o estudo da periodontite peripical em um modelo de mouse acessível e controlado. Portanto, este protocolo tem vantagens sobre amostras de pacientes ou modelos in vitro. As principais vantagens dessa técnica são que o mouse foi bem estudado e que o método é tecnicamente simples em termos de requisitos de instalação e é econômico.
Como esse procedimento é desafiador devido às pequenas dimensões dos dentes, é benéfico visualizar o procedimento para aprender sobre o posicionamento e o desempenho da técnica. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque o mouse no lado dominante da mão em uma superfície de espuma de poliestireno extrudada de célula fechada e fixe as patas com fita adesiva. Usando um único elástico por par de incisivos, e agulhas longas fixadas à superfície de espuma de poliestireno extrudada de células fechadas, abra a boca.
Use fórceps fechados colados na espuma para retrair a bochecha direita. E coloque a espuma e o rato sob um microscópio e uma fonte de luz. Em seguida, retraia a língua usando uma espátula dentária e use uma agulha de calibre 27 para injetar 25 a 50 microlitres de anestésico local na dobra mucobucica adjacente ao primeiro molar mandibular.
Deve-se observar o inchaço tecidual ao redor do local da injeção. Para expor a polpa, use qualquer motor dental adequado equipado com uma broca dentária de alta velocidade, de alta velocidade, a uma velocidade de 800 balas por minuto, para perfurar a parte oclusal do primeiro molar mandibular direito até que os chifres de polpa sejam visíveis através da dentina. Use um arquivo K ou H, número oito ou número 10 para perfurar a polpa e quebrar a dentina que cobre os chifres de polpa mesial e distal para permitir a inserção do arquivo nos chifres.
Continue trabalhando com os arquivos dentro da polpa o mais profundamente possível enquanto amplia as aberturas com os arquivos, sangramento da polpa é tipicamente observado em volta das bordas afiadas do dente com a broca e remover o dente da aclusion para reduzir a dor durante o experimento. Use uma micro escova para limpar qualquer detrito. E deixar o molar mandibular esquerdo contralateral como controle.
Nos três primeiros dias após o procedimento, peso os animais e injete 0,1 miligramas por quilograma de buprenorfina intraperitoneal uma vez por dia. Continue monitorando os animais nos próximos 42 dias pesando e avaliando o comportamento geral de duas a três vezes por semana. E entregar pelotas de alimentos suavizadas com água em uma placa de Petri no chão da gaiola durante todo o período de acompanhamento.
No final do experimento, use tesouras cirúrgicas e fórceps para coletar a parte da mandíbula que inclui os três molares nos lados tratados e não tratados. E use fórceps para descascar o máximo possível do tecido mole, deixando principalmente ossos e dentes nas amostras. Enxágüe o tecido brevemente na PBS.
Antes da fixação em 4% de paraformaldeído por 24 a 48 horas. Em seguida, enxágüe as amostras três vezes em PBS fresco. Para tomografia microcomputada, ou análise microcâmica, os tecidos colhidos em um tubo de 12 milímetros de diâmetro contendo 1,5 mililitros de PBS no estágio do scanner.
Com as amostras orientadas para que as superfícies buccal ou lingual do dente e da raiz colocassem paralelamente à parte inferior do tubo. Use uma esponja para separar as amostras. E cubra a parte superior do tubo com filme flexível.
Selecione o arquivo de controle e defina a energia para 70 quilovolts, a intensidade para 114 micro amperes e a resolução para um tamanho Voxel cubo de seis micrômetros. Clique em Scout-View. Quando a imagem for exibida, clique em Linha de Referência e marque a área das amostras para digitalização, clicando em Adicionar varredura após cada amostra.
Quando todas as amostras tiverem sido marcadas, vá para a lista de tarefas e selecione Iniciar Tarefas de Interação. Para contorno das fatias micro-CT, selecione a fatia que representa o meio aproximado do dente, no qual a polpa coronal, a polpa radicular de ambos os canais, e ambos os forames apical estão presentes. Clique no painel de contorno, e a partir do ponto distal do ápice da raiz distal, marque a borda apical coronally à área paque apical radial, através da borda mesial do ápice raiz mesial, seguindo a borda distal da raiz mesial, e a borda mesial da raiz distal, através da região de furação.
Copie e cole o contorno resultante e ajuste o contorno de acordo com cinco fatias posicionadas em ambos os lados da fatia do meio. Para calcular o volume tecidual do contorno marcado para cada amostra, em Avaliação Micro-CT, selecione Tarefa e clique em Avaliação 3D. Em seguida, na janela de avaliação 3D, clique em Selecionar e selecione um filtro para calcular o volume do tecido.
No final da análise microcutá, transfira os tecidos do scanner para um tubo de micro centrífuga contendo um mililitro de EDTA por 10 dias. Ao final da decalcificação, coloque as amostras em fitas histológicas contendo aumento das concentrações de etanol, durante uma hora por concentração. Após a segunda imersão de etanol, transfira as amostras para xileno para duas horas de imersão, antes de transferir as fitas para a parafina líquida de 60 graus Celsius em um capô químico durante a noite para permitir que o xileno evaporasse.
Na manhã seguinte, coloque as amostras desidratadas com a coroa e raízes orientadas paralelamente ao fundo do molde, em uma máquina de bloqueio histológico para incorporar as amostras em parafina. Para obter seções, fixe a amostra do bloco de parafina no bloco de corte de microtonas e corte a amostra até que o tecido de interesse seja atingido. Quando qualquer parte do dente estiver visível, comece a obter seis seções de espessura de micrômetros, ajustando o ângulo de corte até que seções sagidas que incluem a polpa coronal e radicular e o foramen apical sejam obtidos.
Aqui, toda uma mandíbula tratada é mostrada. A ampliação do molar direito tratado, permite a observação da exposição dos chifres de polpa mesial e distal e da entrada dos canais. A imagem microcsora permite a visualização da exposição da polpa mesial, e as áreas radiolípicas periapical mesalianas e distais da resorda óssea.
De fato, uma resorda óssea periópica significativa do volume tecidual é medida nos dentes tratados, em comparação com os controles. A análise histológica indica que, no dente tratado, a própria polpa dentária apresenta necrose, que pode ser observada claramente após a coloração de H e E em comparação com o tecido de polpa organizado de controle. Além disso, e importante, na região periópica do dente tratado, observa-se uma lesão periípica composta de células imunes, que está ausente nos dentes de controle.
É vital posicionar o camundongo corretamente durante a exposição da polpa, pois um posicionamento correto permite um bom acesso à boca do animal e ótimos resultados. Métodos adicionais de análise de inflamação periópica, como a coloração de tecido imunohistoquímico e o fax e a análise molecular detalhada das células podem ser realizados seguindo este protocolo. Este protocolo é significativo, não apenas para pesquisas odontológicas, mas também para pesquisas imunológicas, pois fornece um modelo para inflamação induzida local com um controle interno embutido.
