Os autores gostariam de reconhecer o NINDS, FightSMA e Famílias de SMA para apoio financeiro. SEGL é suportado por formação NINDS concessão # 5T32NS077984-02.

Todos os procedimentos listados no protocolo foram aprovados Instituto para uso animal e comissão Care (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio. 1. Preparação da área de trabalho <ol><li> Reunir gelo triturado, para anestesiar os filhotes de rato, uma gaiola vazia para segregar a represa da ninhada, um microscópio de dissecação, uma fonte de luz que pode ser posicionado a um ângulo em relação à injecção (utilização de uma fonte de luz em um 90 ° &#160; ângulo em relação ao local da injecção obscurece a veia), uma superfície limpa para colocar o animal para a injecção, cotonetes, 3/10 cc seringa de insulina com 3/8 &quot;de 30 L de agulha (um por animal) e 1% de corante azul de Evans ( feita com) solução salina tamponada com fosfato (PBS) para a formação. </li><li> Retire a barragem de uma gaiola separada ao manipular os filhotes. </li></ol> 2. Injecção Procedimento <ol><li> Coloque um único filhote diretamente no gelo molhado por 30-60 seg para anestesiar o animal. Não deixe tele animais no gelo por muito tempo devido a um risco de complicações associadas à hipotermia relacionada, incluindo a fibrilação ventricular, hipóxia tecidual e acidose metabólica. NOTA: A nossa experiência é que 30-60 segundos é suficiente para abrandar os movimentos filhote de permitir a injecção. Se a anestesia mais profunda é necessária, inalantes, tais como 1-2% de isoflurano pode ser apropriada. </li><li> Enquanto o animal é em gelo, carregar a seringa com 30 ul de corante azul de Evans. </li><li> Quando o animal é completamente anestesiados, confirmada pela falta de movimento no gelo enquanto ainda em respirar, movê-lo sob o microscópio. Para uma injecção destro, enfrentar o focinho do animal para a direita. Coloque o dedo indicador esquerdo no focinho eo caudal dedo médio esquerdo à orelha broto para que a orelha broto é entre o indicador eo dedo médio (Figura 1). </li><li> Examine apenas anterior à orelha broto de um capilar superficial que se move quando a pele é manipulado. Este capilar não é o alvo, no entantoidentificação é importante para a identificação da veia temporal. Em seguida, localize um escuro, sombrio veia inferior ao capilar que permanece fixo, independentemente da posição da pele. A veia temporal, aparece sombreada, corre para ventral dorsal, e alimenta-se na veia jugular (Figura 1). </li><li> Digite a veia temporal com a agulha de bisel para cima. Se inserido corretamente, é possível visualizar os bisel da agulha se enchem de sangue através da pele. Em seguida, pressionar o êmbolo devagar e com nota branqueamento da veia para o lado do rosto. </li><li> Permitir que a agulha para permanecer dentro da veia para um agregado de 10-15 seg para evitar o refluxo do injectant. </li></ol> 3. Pós-injecção <ol><li> Após uma injecção adequada, o filhote deve ficar azul quase que imediatamente. Remover a agulha e usar a força suave para aplicar um cotonete para o local de injecção até que os coágulos de sangue. </li><li> Monitorar o filhote para sinais de sofrimento. Permitir que o filhote 2-3 min para recuperar e reaquecer, recognize quando o filhote está consciente, de pé e em movimento, antes de voltar para a jaula. Taça dos filhotes nas mãos enluvadas do investigador para fornecer calor adequado para ajudar na recuperação, se necessário. Como alternativa, coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola para facilitar o aquecimento do filhote injetado. Geralmente depois de uma injeção de corante azul de Evans, eutanásia filhotes. Não incluem corante ao injetar o material de teste. </li><li> Coloque o filhote de volta para a gaiola e garantir que o filhote é revestido com roupa de cama e / ou nestlet para garantir reacceptance pela barragem. </li><li> Use uma seringa nova e cotonete para cada cachorro para manter a esterilidade. </li></ol>

<ol>
	<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nature. 27, 59-65 (2009).</li><li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+scAAV9+delivery+of+a+codon-optimized+SMN1+sequence+rescues+SMA+mice.">Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice.</a> Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).</li><li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+AAV2/9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system.">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+spinal+muscular+atrophy+phenotype+in+a+mouse+model+by+early+postnatal+delivery+of+SMN.">Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN.</a> Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).</li><li>Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV-9+transduction+in+mice+is+influenced+by+animal+age+but+not+by+the+route+of+administration.">Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration.</a> Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).</li><li>Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+transfer+into+the+CNS+across+the+BBB+after+neonatal+systemic+delivery+of+single-stranded+AAV+vectors.">Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors.</a> Brain research. 1389, 19-26 (2011).</li><li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse.">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li><li>Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+neonatal+intravascular+injections:+modeling+newborn+disease.">Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J. vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sands, M. S., Barker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+intravenous+injection+in+neonatal+mice.">Percutaneous intravenous injection in neonatal mice.</a> Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).</li><li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+heart+failure+in+the+SMNDelta7+model+of+spinal+muscular+atrophy+and+correction+by+postnatal+scAAV9-SMN+delivery.">Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery.</a> Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).</li><li>Valori, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+scAAV9+expressing+SMN+prolongs+survival+in+a+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy.</a> Science translational medicine. 2, (2010).</li><li>Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+intraperitoneal+or+intravenous+injections+of+recombinant+adeno-associated+virus+type+8+transduce+dorsal+root+ganglia+and+lower+motor+neurons.">Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons.</a> Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).</li><li>Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaucher+disease.">Gaucher disease.</a> Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).</li><li>Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+gene+transfer+leads+to+widespread+correction+of+pathology+in+a+murine+model+of+lysosomal+storage+disease.">Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).</li><li>Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+systemic+clinical+disease+in+MPS+VII+mice+following+AAV-mediated+neonatal+gene+transfer.">Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer.</a> Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juvenile+neuronal+ceroid+lipofuscinoses.">Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome.">Bardet-Biedl syndrome.</a> European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).</li><li>Bevan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+gene+delivery+in+large+species+for+targeting+spinal+cord,+brain,+and+peripheral+tissues+for+pediatric+disorders.">Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders.</a> Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li><li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective,+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9.">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS.">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A entrega intravascular de agentes para o SNC ou por todo o corpo é difícil em modelos murinos de doença neonatal. O protocolo descrito é uma maneira rápida, relativamente não-invasivo para administrar por via intravenosa soluções em camundongos neonatal com requisitos mínimos de equipamento. Embora a cara veia temporal, podem ser vistos a olho nu, as injecções podem ter maior precisão com o uso do microscópio e fonte luminosa de fibra óptica, especialmente para um injector sem prática. Injeções intrave...

A entrega de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC) em modelos murinos de doença pediátrica continua a ser um desafio. Ratos que modelo estados de doença recém-nascidos são subdimensionados e developmentally imaturo, e, portanto, pode ser difícil de injectar directamente nas estruturas apropriadas dentro do SNC. Injeção intravascular de agentes terapêuticos é um método não-invasivo, bem tolerado para entregar células, drogas ou vetores virais para todo o corpo, incluindo o SNC 1-5 e 3,5-9 retina. Publicações anteriores descrevem injeção veia rosto temporal, utilizando um transiluminador 10,11, sem um microscópio de dissecação 11,12, ou exigindo duas pessoas para injetar 10. A técnica de injeção descritos neste protocolo é vantajoso porque um único indivíduo pode injetar filhotes, ea fonte de luz para ver a veia temporal, não está tocando o filhote, eliminando a necessidade de fita cirúrgica ou a fixação de um filhote de cachorro para uma superfície fixatal como um transiluminador 11. Entrega de adeno-associado vector viral serótipo 9 (AAV9) em ratinhos produz expressão robusta em neurónios e astrócitos em todo o cérebro e na medula espinal (Figura 1). A entrega intravascular de vectores virais na veia facial temporal superficial foi usado de forma fiável em vários estudos em ratinhos neonatais para tratar a doença neuromuscular pediátrica atrofia muscular espinal (SMA) e, finalmente, 2,4,13,14 aumentou o tempo de vida dos ratinhos tratados. Injecção intravascular de ratinhos neonatais também tem como alvo de forma eficaz o sistema nervoso periférico e órgãos periféricos (Figura 2). Após a injecção de AAV, a transdução de gânglios da raiz dorsal, fígado, coração, músculo esquelético, o pulmão, e do plexo mientérico do intestino foi observada 1,3,6,7,15. Transdução generalizada do sistema nervoso central e periferia torna este método de injeção ideal para doenças que requerem expressão global deum transgene, tais como a doença de 16 e outro de depósito lisossômico doenças de Gaucher, doença de 17,18 Batten e lipofuscinoses Ceróides neuronais relacionados, 19 e síndrome de Bardet-Biedl, uma doença genética do sistema múltiplo com início dos sintomas que ocorrem na infância 20. Injecção intravascular em ratinhos neonatais, também deve ser considerado como um novo método de doenças pediátricas em todo o sistema de modelagem. Esta técnica tem sido traduzido para animais de grande porte 5,21 e injeção intravascular já existe como um método clinicamente aceitável de entregar terapêutica. O protocolo atual descreve um método simples e eficiente de agentes para ratos neonatais entregar através da veia superficial rosto temporal, o mais tardar até dia pós-natal 2. Injeção pode ser completado por um único, praticada individual e é bem tolerado por ambos os filhotes e as barragens. Filhotes experimentar angústia mínima e recuperar rapidamente. Importantly, injecção bem sucedido resultará na entrega global do agente administrado. Este protocolo é apropriado para a entrega de vectores virais, agentes farmacêuticos ou de células para ratinhos recém-nascidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:188px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thinpro Insulin Syringe</td>
			<td style="width:103px;">Terumo</td>
			<td>SS30M3009</td>
			<td style="width:188px;">3/10cc, 3/8&#34; needle, 30G, 1 per mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Evans Blue Dye</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E2129</td>
			<td style="width:188px;">Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fiber Optic Light Source&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12-562-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravenous injections in neonatal mice

A injeção intravenosa é uma forma clinicamente aplicável para entregar terapêutica. Para roedores adultos e animais maiores, injeções intravenosas são tecnicamente viáveis ​​e de rotina. No entanto, alguns modelos de mouse pode ter início precoce da doença com uma progressão rápida que torna a administração de terapias potenciais difícil. A veia temporal (ou facial) é apenas anterior ao botão da orelha em ratinhos e é claramente visível para os dois primeiros dias após o nascimento em cada lado da cabeça, usando um microscópio de dissecação. Durante esta janela, a veia temporal, podem ser injectados com volumes de até 50 ul. A injecção é seguro e bem tolerado por ambas as crias e as barragens. Um procedimento típico de injecção está concluída dentro de 1-2 min, após o que o filhote é devolvida à gaiola de origem. No terceiro dia pós-natal a veia é difícil de visualizar e do procedimento de injeção se torna tecnicamente confiável. Esta técnica tem sido utilizada para a entrega de vírus adeno-associado (AAV) vectors, que por sua vez pode fornecer quase todo o corpo, a expressão do transgene estável durante a vida do animal, dependendo do serotipo viral escolhido.

Durante uma injecção adequada, a veia deve momentaneamente virar clara, ou branquear. Se injetar tingir todo o filhote deve ficar azul em segundos. Se uma injecção indevida tenha ocorrido, há muitas vezes um bolus subcutâneo concentrada na cabeça ou pescoço e injectant pode verter para fora do local de injecção. Injecções impróprios também pode resultar no aparecimento de nódoas negras em torno da garganta. Os filhotes que recebem injeções subcutâneas (ou seja, a injeção não foi totalmente ...

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Intravenous Injections in Neonatal Mice

Modelos animais de doença pediátrica pode experimentar início precoce e progressão da doença agressiva. Clinicamente entrega terapia relevantes para jovens modelos de mouse pode ser tecnicamente difícil. Este protocolo descreve um método de injecção intravenosa não-invasiva para a ratinhos recém-nascidos nos dois primeiros dias pós-natais de vida.

Injeções intravenosas em Neonatal Ratos

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Research

JoVE Journal

Biology

57.5K visualizações.  Ohio State University.  Modelos animais de doença pediátrica pode experimentar início precoce e progressão da doença agressiva. Clinicamente entrega terapia relevantes para jovens modelos de mouse pode ser tecnicamente difícil. Este protocolo descreve um método de injecção intravenosa não-invasiva para a ratinhos recém-nascidos nos dois primeiros dias pós-natais de vida. 