Nossos protocolos fornecem um ponto de partida para estudos funcionais de desenvolvimento de lentes e fisiologia e para rastreamento genético reverso de fenótipos de lentes em zebrafish. Nossos protocolos fazem uma ponte in vitro e in vivo de análises in vitro e in vivo da morfologia da membrana da lente zebrafish e fornecem um novo e simples método para quantificar o desenvolvimento da óptica das lentes de zebrafish. Analisar a morfologia e a óptica das lentes de zebrafish leva a insights sobre mecanismos que controlam o desenvolvimento das lentes, a fisiologia normal e a fisiopatologia.
Esses insights, por sua vez, podem levar a uma capacidade de retardar ou prevenir a catarata. Não houve relatos em espécies além de zebrafish de núcleos de lentes assimétricamente localizados. Identificar suturas de lentes é fundamental para orientar corretamente a lente para medir a localização do núcleo.
Após a confirmação de sedação suficiente com Tricaine, use uma tesoura de microdisseção para extirir imediatamente ambos os olhos de um peixe-zebra adulto ou larval e colocar ambos os olhos em uma placa de Petri personalizada de 35 milímetros com um molde de dissecção de silicone preenchido com PBS. Para colher a lente de um zebrafish adulto, coloque o lado posterior do olho para cima e insira fórceps em um ângulo de menos de 45 graus através do disco óptico. Use a tesoura de dissecção para fazer duas ou três incisões radiais através da retina e esclera do disco óptico para a zona ciliar no olho imobilizado e descascar a retina e esclera como pétalas de flores.
Inverta o olho, cornea-side para cima, e use o lado plano da tesoura para imobilizar a lente indiretamente através da manipulação da esclera e córnea usando fórceps para afastar a retina e tecidos ligados, em seguida, cuidadosamente cortar qualquer excesso de tecido da lente. Para a colheita da lente de zebrafish larval, coloque um lado posterior do olho larval sobre a parte plana de um prato de silicone de PBS e use uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobiliza o olho com outra agulha ou fórceps, em seguida, colher suavemente a lente do olho dissociado com o lado contundente de uma agulha de fio de tungstênio feito sob medida e cuidadosamente puxar o tecido ligado. Para medir a localização do núcleo de lentes do eixo anterior-posterior, oriente as lentes recém-excisadas axially em PBS em um prato de 35 milímetros com um fundo de vidro de cobertura com os polos e suturas orientadas paralelamente ao plano de foco.
Para identificar o núcleo da lente, procure uma diferença no índice de refração, que geralmente ocorre na interface do córtex da lente e núcleo da lente. Se as suturas das lentes não forem aparentes, uma leve lambida com fórceps na cápsula da lente revela as suturas e o núcleo da lente, ajudando a orientar a lente para a medição. Coloque o prato no palco de um microscópio de dissecção equipado com uma câmera e imagem das lentes com o núcleo da lente em foco sob iluminação brightfield ou com sensibilidade de contraste de interferência diferencial.
Imagem um micrômetro sob a mesma ampliação para calibração e clique em Live View. Clique em Snapshot para obter uma imagem e salvar a imagem como um arquivo TIFF. Para calibrar as imagens da lente adquirida, em um programa de software apropriado de processamento de imagem, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha de comprimento conhecido na imagem do micrômetro.
Clique em Analisar e Definir escala e digitar a distância e unidades conhecidas, em seguida, selecione Calibração Global e clique em OK. Para medir a distância do centro do núcleo da lente até o polo anterior, identifique a localização da sutura da lente e use a ferramenta de linha reta para desenhar uma linha através do centro de imagens do núcleo da lente em uma orientação axial. O centro desta linha é o centro do núcleo das lentes. Desenhe outra linha deste ponto para o polo anterior da lente e selecione Medir no menu Analisar para medir a distância.
Desenhe outra linha do polo anterior para o polo posterior e meça essa distância como diâmetro da lente, em seguida, copie esses comprimentos da janela Resultados para uma planilha e calcule a localização normalizada do núcleo da lente em relação ao raio da lente. Por três dias após a fertilização, as suturas anteriores formam-se no polo anterior e a convergência marcante das células é claramente visualizada pela coloração da fábula das membranas celulares de fibra estreita em embriões fixos. A rotulagem celular de fibra ampla mais forte na membrana de lente localizada mApple transgênico permite visualização ao vivo de subdomínios de membrana, mas não tem a convergência sutural.
As suturas posteriores podem ser visualizadas tanto in vitro quanto in vivo em três dias após a fertilização. Em um plano equatorial, a faloideina rotula fortemente as células externas de fibra cortical, revelando uma forma hexagonal achatada. A falooidina é excluída do núcleo de lentes compactadas e do tipo selvagem e das lentes mutantes parecem indistinguíveis.
A forte rotulagem de células de fibra ampla em mosaicos mApple localizados em membrana de lentes revelam interrupções no volume celular dentro da lente mutante. Como a expressão transgênica não é limitada pela permeabilidade, alguns mosaicos revelam rotulagem do núcleo de lentes. Em animais do tipo selvagem, o núcleo das lentes começa mais perto do polo de lente anterior durante os estágios iniciais de desenvolvimento antes de centralizar durante a vida adulta.
Expressão de proteínas com marca verde em um hospedeiro transgênico no qual as membranas celulares fluoresce vermelho permite a localização simultânea da proteína, bem como a avaliação da morfologia das células de fibra in vivo. Os zebrafish são especialmente adequados para estudos in vivo. Usando as ferramentas descritas aqui, podemos sondar mecanismos de lentes, em grande parte estudados in vitro, em um sistema in vivo.
