우리의 프로토콜은 렌즈 발달과 생리학의 기능적 연구와 제브라피시의 렌즈 표현형의 역유전 적 스크리닝을 위한 출발점을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 체외 및 제브라피시 렌즈 막 형태에 대한 생체 내 분석을 교개하고 제브라피시 렌즈 광학의 개발을 정량화하는 새롭고 간단한 방법을 제공합니다. Zebrafish 렌즈 형태와 광학을 분석하면 렌즈 개발, 정상적인 생리학 및 병리학을 제어하는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
이러한 통찰력은 백내장을 지연하거나 방지하는 기능으로 이어질 수 있습니다. 비대칭 국소화 된 렌즈 핵의 제브라피 이외의 종에 있는 보고가 없었습니다. 렌즈 봉합사를 식별하는 것은 렌즈를 올바르게 방향을 지정하여 핵 국소화를 측정하는 데 중요합니다.
트리카인으로 충분한 식기 처리가 확인된 후, 미세 절부 가위를 사용하여 성인 또는 유충 얼룩말에서 두 눈을 즉시 소비하고 PBS로 채워진 실리콘 해부 몰드가있는 35 mm 의 맞춤형 페트리 접시에 두 눈을 배치하십시오. 성인 얼룩말물고기에서 렌즈를 수확하려면 눈 뒤쪽 면을 위로 올려 놓고 광학 디스크를 통해 45도 미만의 각도로 집게를 삽입합니다. 해부 가위를 사용하여 망막과 클클레라를 통해 망막과 경각증을 통해 정광된 눈의 섬모 영역까지 두 개 또는 세 개의 방사형 절개를 하고 꽃잎처럼 망막과 경감을 벗깁니다.
눈을 반전시키고 각막면을 위로 하고 가위의 평평한 면을 사용하여 포셉을 사용하여 렌즈를 밀착한 후 렌즈에서 여분의 조직을 조심스럽게 다듬어 서 스클레라와 각막의 조작을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시합니다. 애벌레 얼룩말 렌즈 수확을 위해, PBS의 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 배치하고 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정하는 동안 망막과 sclera를 통해 방사형 컷을 만들기 위해 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여, 부드럽게 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정한 다음 부드럽게 분리 된 눈의 무딘 측면과 함께 분리 된 눈의 렌즈를 스쿱합니다. 전방 후방 축 렌즈 핵 국소화를 측정하기 위해 PBS에서 갓 익힌 렌즈를 35mm 접시에 넣고 표지 유리 바닥과 초점 평면과 평행하게 향합니다.
렌즈 핵을 식별하려면 일반적으로 렌즈 피질 및 렌즈 핵의 인터페이스에서 발생하는 굴절률의 차이를 찾습니다. 렌즈 봉합사가 명백하지 않은 경우 렌즈 캡슐에 집게로 약간 핥으면 봉합사와 렌즈 핵이 드러나므로 측정을 위해 렌즈를 방향을 지정하는 데 도움이됩니다. 카메라를 장착한 해부 현미경의 무대에 접시를 놓고 렌즈 핵을 밝은 시야 조명 아래 또는 차동 간섭 대비 광학으로 이미지화합니다.
교정을 위해 동일한 배율 아래 마이크로미터를 이미지화하고 Live View를 클릭합니다. 스냅샷을 클릭하여 이미지를 가져오고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 획득한 렌즈 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 보정하려면 직선 도구를 선택하고 마이크로미터 이미지에 알려진 길이의 선을 그립니다.
스케일 분석 및 설정을 클릭하고 알려진 거리와 단위를 입력한 다음 전역 보정을 선택하고 확인을 클릭합니다. 렌즈 핵의 중심에서 전방 극까지의 거리를 측정하려면 렌즈 봉합사의 위치를 식별하고 직선 도구를 사용하여 축 방향으로 렌즈 핵의 이미지 중앙을 가로 질러 선을 그립니다. 이 선의 중심은 렌즈 핵의 중심입니다. 이 점에서 렌즈의 전방 기둥에 다른 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정값을 선택하여 거리를 측정합니다.
전방 기둥에서 후방 극에 다른 선을 그리고 렌즈 직경으로 이 거리를 측정한 다음 결과 창에서 스프레드시트에 이러한 길이를 복사하고 렌즈 반경과 관련하여 렌즈 핵의 정규화된 현지화를 계산합니다. 3일 후 수정함으로써 전방 봉합사는 전방 기둥에서 형성되며 세포의 눈에 띄는 수렴은 고정 배아에서 좁은 섬유 세포막의 파종염 염색에 의해 명확하게 시각화된다. 렌즈 막국화 mApple 형질화에서 강력한 광섬유 세포 라벨은 멤브레인 하위 도메인의 라이브 시각화를 허용하지만 봉제 수렴이 부족합니다.
후방 봉합사는 3일 후에 시험관내와 생체내에서 모두 시각화할 수 있다. 적도 평면에서, phalloidin 강하게 외부 피질 섬유 세포를 레이블, 평평한 육각형을 공개. Phalloidin은 압축 렌즈 핵과 야생 유형 및 돌연변이 렌즈 구별 할 수없는 모양에서 제외됩니다.
렌즈 멤브레인 국소화 된 mApple 모자이크 트랜스제닉에서 광범위한 섬유 세포의 강력한 라벨은 돌연변이 렌즈 내의 세포 부피의 혼란을 보여줍니다. 트랜스진 발현은 투과성에 의해 제한되지 않기 때문에 일부 모자이크는 렌즈 핵 라벨링을 드러냅니다. 야생 형 동물에서, 렌즈 핵은 성인기 도중 중앙 집중화하기 전에 발달의 초기 단계 도중 전방 렌즈 극에 더 가깝게 시작합니다.
세포막이 적색형광을 하는 형질전환 숙주에서 녹색 태그가 달린 단백질의 발현은 생체 내 섬유 세포 형태에 대한 평가뿐만 아니라 동시 단백질 국소화를 허용한다. Zebrafish는 특히 생체 내 연구에 적합합니다. 여기에 설명된 도구를 사용하여, 우리는 생체 내 시스템에서 주로 시험관 내에서 연구된 렌즈 메커니즘을 프로브할 수 있습니다.
