Наши протоколы являются отправной точкой для функциональных исследований развития линз и физиологии, а также для обратного генетического скрининга фенотипов линз у зебры. Наши протоколы мост в пробирке и in vivo анализы зебры линзы мембранной морфологии и обеспечить новый и простой метод количественной оценки развития оптики объектива зебры. Анализ морфологии линз зебры и оптики приводит к пониманию механизмов, контролирующих развитие хрусталика, нормальной физиологии и патофизиологии.
Эти идеи, в свою очередь, может привести к способности задерживать или предотвращать катаракту. Там не было никаких сообщений в видах, кроме зебры асимметрично локализованных ядер объектива. Определение шовов объектива имеет решающее значение для правильного ориентировки объектива для измерения локализации ядра.
После подтверждения достаточного sedation с Tricaine, используйте ножницы microdissection немедленно excise оба глаза от или взрослого или larval zebrafish и поместите оба глаза в 35-миллиметровую изготовленную на заказ чашку Петри с силиконовой формой вскрытия заполненной с PBS. Чтобы собрать объектив у взрослой зебры, поместите заднюю сторону глаза вверх и вставьте миппы под углом менее 45 градусов через оптический диск. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы сделать два или три радиальных разреза через сетчатку и склеру от оптического диска до цилиарной зоны в обездвиженные глаза и очистить назад сетчатки и склеры, как лепестки цветов.
Инвертировать глаз, роговицы стороне вверх, и использовать плоскую сторону ножниц для обездвиживания объектива косвенно с помощью манипуляции склеры и роговицы с помощью миппов, чтобы вытащить сетчатки и прилагается тканей, а затем тщательно обрезать любые избыточные ткани из объектива. Для личинки зебрафиш объектив урожая, место личинки глаз задней стороне вверх на плоскую часть силиконовой блюдо PBS и использовать заточенные вольфрама иглы, чтобы сделать радиальные разрезы через сетчатку и склеру в то время как иммобилизация глаза с другой иглой или типсами, а затем осторожно черпать объектив из диссоциированного глаза с тупой стороной на заказ вольфрама проволоки иглы и тщательно вытащить. Для измерения локализации ядра передней и задней оси объектива ориентируйте свежевырезанные линзы аксиально в PBS в 35-миллиметровое блюдо с крышкой стекла с полюсами и швами, ориентированными параллельно плоскости фокусировки.
Чтобы определить ядро объектива, ищите разницу в рефракционном индексе, который обычно возникает на стыке коры хрусталика и ядра объектива. Если линзы швы не являются очевидными, небольшое лизать с миппами к капсуле объектива показывает швы и ядро объектива, помогая сориентировать объектив для измерения. Поместите блюдо на сцену микроскопа вскрытия, оснащенного камерой и изображением линз с ядром объектива в фокусе под ярким освещением поля или с дифференциальной интерференционной контрастной оптикой.
Изображение микрометра под тем же увеличением для калибровки и нажмите Live View. Нажмите Snapshot, чтобы получить изображение и сохранить изображение в качестве файла TIFF. Для калибровки полученных изображений объектива в соответствующей программе обработки изображений выберите инструмент прямой линии и нарисуйте линию известной длины на микрометровом изображении.
Нажмите Анализ и Установите шкалу и введите известное расстояние и единицы, затем выберите глобальную калибровку и нажмите OK. Для измерения расстояния от центра ядра объектива до переднего полюса определите расположение шва объектива и используйте инструмент прямой линии, чтобы нарисовать линию через изображенный центр ядра объектива в осяной ориентации. Центром этой линии является центр ядра объектива. Нарисуйте другую линию от этой точки к передней полюса объектива и выберите Мера в меню анализа для измерения расстояния.
Нарисуйте другую линию от переднего полюса до заднего полюса и измерьте это расстояние как диаметр объектива, затем скопировать эти длины из окна Результатов в электронную таблицу и рассчитать нормализованную локализацию ядра объектива по отношению к радиусу объектива. К трем дням после оплодотворения на передней части полюса образуются передние швы, и поразительное сближение клеток четко визуализируется фаллоидином, окрашивая узкие мембраны волоконных клеток в фиксированные эмбрионы. Более сильная маркировка клеток широкого волокна в мембране объектива локализованных трансгенных mApple позволяет живая визуализация мембранных субдоменов, но не имеет sutural конвергенции.
Задние швы можно визуализировать как в пробирке, так и в виво в течение трех дней после оплодотворения. В экваториальной плоскости фаллоидин сильно маркирует наружные клетки корковых волокон, открывая сплющенную шестиугольную форму. Фаллоидин исключен из уплотненого ядра объектива и дикий тип и мутант объектив выглядят неотличимыми.
Сильная маркировка широких волоконных клеток в мембранных мембранах линз, локализованных трансгеникой mApple, выявляет нарушения в объеме клеток в объективе мутанта. Поскольку трансгенное выражение не ограничено проницаемостью, некоторые мозаики показывают маркировку ядра объектива. У диких животных типа, ядро объектива начинается ближе к передней полюса объектива на ранних стадиях развития до централизации во взрослом возрасте.
Выражение зеленых белков в трансгенном хозяине, в котором клеточные мембраны флуоресцентный красный позволяет одновременно локализации белка, а также оценки морфологии клеток волокна in vivo. Зебрафиш особенно хорошо подходит для исследований in vivo. Используя описанные здесь инструменты, мы можем исследовать механизмы объектива, в значительной степени изученные в пробирке, в системе in vivo.
