Protokollerimiz, lens gelişimi ve fizyolojisi ile ilgili fonksiyonel çalışmalar ve zebra balıklarında lens fenotiplerinin ters genetik taraması için bir başlangıç noktası sağlamaktadır. Protokollerimiz in vitro ve in vivo zebrafish lens membran morfolojisi analizleri arasında köprü kurar ve zebrabalığı lens optiklerinin gelişimini ölçmek için yeni ve basit bir yöntem sağlar. Zebrabalığı lens morfolojisi ve optik analizleri, lens gelişimini, normal fizyolojisini ve patofizyolojisini kontrol eden mekanizmalara ışık tutar.
Bu anlayışlar da katarakt geciktirmek veya önlemek için bir yetenek yol açabilir. Asimetrik lokalize lens çekirdeklerinin zebra balığı dışında türlerde rapor edilmemiştir. Lens dikişlerinin tanımlanması, çekirdeğin lokalizasyonunu ölçmek için lensin doğru şekilde yönlendirilmesi için çok önemlidir.
Tricaine ile yeterli sedasyon onaysonra, hemen bir yetişkin ya da bir larva zebra balığı her iki göz çıkarmak ve pbs ile dolu bir silikon diseksiyon kalıp ile 35 milimetrelik özel yapılmış Petri çanak içine her iki göz almak için mikrodiseksiyon makas kullanın. Lensi yetişkin bir zebra balığından almak için, göz arka tarafını yukarı yerleştirin ve optik diskten 45 dereceden daha az bir açıyla forceps takın. Optik diskten immobilize gözdeki sifiye bölgesine retina ve sklera yoluyla iki veya üç radyal kesi yapmak için diseksiyon makası kullanın ve çiçek yaprakları gibi retina ve sklera geri soyma.
Gözü ters çevirin, kornea tarafı, ve retina ve bağlı dokuları çekmek için forceps kullanarak sklera ve kornea manipülasyonu yoluyla dolaylı olarak lens hareketsizleştirmek için makas düz tarafı kullanın, sonra dikkatle lens herhangi bir fazla doku kırpma. Larva zebrabalığı lens hasat için, PBS bir silikon çanak düz kısmına bir larva göz arka tarafı yerleştirin ve başka bir iğne veya forseps ile göz immobilize ederken retina ve sklera ile radyal kesikler yapmak için keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın, sonra yavaşça özel bir tungsten tel iğne snkün tarafı ile ayrışmış göz den lens kepçe ve dikkatlice bağlı doku çekin. Anterior-posterior eksen lens çekirdeğinin lokalizasyonunu ölçmek için, pbs'de yeni eksintif lensleri, odak düzlemine paralel kutuplu ve dikişli bir kapak cam alt kısmıyla 35 milimetrelik bir çanak tasnif edin.
Lens çekirdeğini tanımlamak için, genellikle lens korteks ve lens çekirdeğinin arabiriminde meydana gelen kırılma indisi ile bir fark arayın. Lens dikişleri belirgin değilse, lens kapsülüne forseps ile hafif bir yalama dikişleri ve lens çekirdeğini ortaya çıkarır ve lensin ölçüm için yönlendirilmesine yardımcı olur. Çanak makine ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu sahnesine yerleştirin ve lens çekirdeği ile mercek görüntüleri parlak alan aydınlatma altında odak veya diferansiyel girişim kontrast optik ile.
Kalibrasyon için aynı büyütmenin altında bir mikrometre görüntüleyin ve Canlı Görünüm'e tıklayın. Görüntü elde etmek ve resmi TIFF dosyası olarak kaydetmek için Anlık Görüntü'yi tıklatın. Edinilen lens görüntülerini kalibre etmek için, uygun bir görüntü işleme yazılımı programında, düz çizgi aracını seçin ve mikrometre görüntüsüüzerinde bilinen uzunlukta bir çizgi çizin.
Analiz et ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatın ve bilinen mesafeyi ve birimleri girin, ardından Genel kalibrasyon'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Lens çekirdeğinin merkezinden ön direğe olan uzaklığı ölçmek için, lens sütürünün yerini belirleyin ve eksenel bir yönde lens çekirdeğinin görüntülenmiş merkezine bir çizgi çizmek için düz çizgi aracını kullanın. Bu çizginin merkezi mercek çekirdeğinin merkezidir. Bu noktadan lensin ön direğine başka bir çizgi çizin ve mesafeyi ölçmek için Analyze menüsünde Ölçü'yü seçin.
Ön kutuptan arka direğe başka bir çizgi çizin ve bu mesafeyi lens çapı olarak ölçün, ardından bu uzunlukları Sonuçlar penceresinden bir elektronik tabloya kopyalayın ve lens yarıçapına göre lens çekirdeğinin normalleştirilmiş yerelleştirilmesini hesaplayın. Üç gün sonra döllenme, ön kutupta ön dikişler oluşur ve hücrelerin çarpıcı yakınsaması sabit embriyolarda dar lif hücre zarlarının phalloidin boyama ile açıkça görselleştirilir. Lens membran lokalize mApple transgeninde daha güçlü geniş lifli hücre etiketlemesi membran alt etki alanlarının canlı görselleştirilmesine olanak sağlar, ancak sutural yakınsamadan yoksundır.
Posterior dikişler hem in vitro hem de in vivo döllenme sonrası üç gün içinde görüntülenebilir. Ekvatoral düzlemde, phalloidin güçlü dış kortikal lif hücreleri etiketler, düzleştirilmiş altıgen şekli ortaya. Phalloidin sıkıştırılmış lens çekirdeği ve yabani tip ve mutant lens ayırt edilemez bir görünüm hariçtir.
Lens membran lokalize mApple mozaiklerinde geniş lif hücrelerinin güçlü etiketlemesi, mutant lensin hücre hacminde bozulmaları ortaya koymaktadır. Transgen ekspresyonu geçirgenlikle sınırlı olmadığı için bazı mozaikler mercek çekirdeği etiketlemeyi ortaya çıkarır. Vahşi tip hayvanlarda, lens çekirdeği yetişkinlik döneminde merkezileşmeden önce gelişmenin erken aşamalarında ön lens direğine daha yakın başlar.
Hücre zarlarının floresan kırmızı olduğu transgenik konaktaki yeşil etiketli proteinlerin ekspresyonu eşzamanlı protein lokalizasyonunun yanı sıra in vivo'da lif hücresi morfolojisinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Zebra balıkları in vivo çalışmalar için özellikle uygundur. Burada açıklanan araçları kullanarak, mercek mekanizmalarını inceleyebiliriz, büyük ölçüde in vitro olarak incelenmiştir, in vivo bir sistemde.
