Proteínas de ligação de RNA são essenciais para a fisiologia celular. É importante ressaltar que o RBP é altamente expresso ao longo da espermatogênese e tem sido bem documentado como reguladores pós-transcrição essenciais durante todas as fases das células germinativas. A identificação de alvos vinculantes é fundamental para elucidar os papéis mecanicistas do RBP.
Este protocolo representa uma aplicação adaptada do método eCLIP para capturar alvos rna diretos endógenos e estabelece uma base aplicável para eCLIP em testíase de mamíferos. A principal vantagem deste método é que ele não é radioativo, menos demorado, e fornece uma relação sinal-ruído mais forte, porque a entrada compatível com o tamanho servirá como um fundo apropriado para alvos autênticos. Por último, achamos que o sequenciamento em pequena escala de subclonas é útil para seguir o sequenciamento profundo.
Demonstrando o procedimento será Xu Qiushi, meu colega. Para iniciar este procedimento, colher cerca de 100 miligramas de testículos de camundongos de idade apropriada para cada experimento de imunoprecipitação. Coloque os tecidos em PBS gelado.
Usando um par de pinças finas, remova suavemente a tunica albuginea. Adicione três mililitros de PBS gelado a um moedor de tecido, e use um pilão de vidro solto para triturar o tecido por força mecânica leve. Em seguida, transfira a suspensão do tecido para um prato de cultura celular, e adicione PBS gelado até seis mililitros.
Agite a placa rapidamente para que o líquido cubra o fundo do prato uniformemente. Cruze a suspensão no gelo três vezes com 400 milímetros por centímetro ao quadrado a 254 nanômetros. Certifique-se de misturar a suspensão entre cada irradiação.
Em seguida, recolhe a suspensão em um tubo cônico de 15 mililitros, e centrífuga a 1.200 vezes g e a quatro graus por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspense a pelota em um mililitro de PBS. Depois disso, transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 1.000 vezes g e a quatro graus Celsius por dois minutos, e descartar o supernaspe. Primeiro, adicione 125 microliters de proteína A contas magnéticas por amostra a um tubo de centrífuga fresco. Coloque o tubo sobre o ímã para separar as contas da solução.
Após 10 segundos, remova o supernasciente e lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de lise gelada. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lise fria com 10 microgramas de anticorpo eCLIP. Gire os tubos em temperatura ambiente por 45 minutos.
Em seguida, lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de lise gelada. Para começar, resuspenque as pelotas de tecido em um mililitro de tampão de lise fria contendo 22 microliters de coquetel inibidor de proteína livre de 50x EDTA e 11 microliters de inibidor de RNase. Continue ingindo as amostras no gelo por 15 minutos.
Sonicate cada amostra conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione quatro microliters de DNase a cada tubo e misture bem. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos enquanto treme a 1.200 rpm.
Depois disso, adicione 10 microliters de RNase diluído e misture bem. Incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos enquanto treme a 1.200 rpm. Em seguida, centrífuga a 15.000 vezes g e a quatro graus Celsius por 20 minutos para limpar o lysate.
Colete cuidadosamente o supernasário e guarde amostras de entrada para amostras de RWB e RRI. Primeiro, adicione um mililitro do lysate às contas preparadas, e gire as amostras a quatro graus Celsius durante duas horas ou durante a noite. Depois disso, colete as contas com um suporte magnético, e descarte o supernatante.
Lave as contas duas vezes com 900 microliters de tampão de sal alto e depois lave as contas duas vezes com 900 microliters de tampão de lavagem. Em seguida, lave as contas uma vez com 500 microliters de 1x tampão de desfosforilação. Primeiro, descarte o supernaspe e use pontas finas de pipeta para remover qualquer líquido residual.
Adicione 25 microliters de mistura mestre de ligadura de três primes a cada amostra e cuidadosamente pipeta para misturar. Adicione 2,5 microliters do adaptador RNA X1A e 2,5 microliters do adaptador RNA X1B a cada amostra. Misture cuidadosamente por pipetar ou piscar.
Incubar a 25 graus Celsius por 75 minutos, certificando-se de mexer o tubo para misturar a cada 10 minutos. Lave as contas uma vez com 500 microliters de tampão de lavagem a frio. Em seguida, lave as contas uma vez com 500 microliters de tampão frio de sal alto e, em seguida, com 500 microliters de tampão de lavagem a frio.
Repita as duas lavagens mais uma vez. Separe magneticamente as contas e use pontas finas de pipeta para remover qualquer líquido residual. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lavagem a frio, e mova 20 microliters para novos tubos como amostras de RWB.
Adicione 7,5 microliters de tampão de amostra 4x LDS e três microliters de 10x agente redutor de amostras às amostras restantes. Incubar a 70 graus Celsius por 10 minutos enquanto treme a 1.200 rpm. Depois disso, esfrie as amostras no gelo por um minuto, e centrífuga a 1.000 vezes g e a quatro graus Celsius por um minuto.
Para gel RWB, coloque tubos em um ímã e eluvar proteínas separadas das contas. Carregue 15 microliters de amostra em cada poço. Em seguida, adicione 500 microliters de antioxidante a 500 mililitros de 1x SDS em execução tampão.
Execute o gel a 200 volts, 1x SDS executando buffer por 50 minutos ou até que a frente de corante esteja na parte inferior. Transfira os complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana nitrocelulose a 10 volts por 70 minutos em 1x de tampão de transferência com 10% de metanol. Bloqueie a membrana RWB em 5% de leite em TBST à temperatura ambiente por uma hora.
Enxágüe a membrana em TBST e incubar com anticorpo primário em TBST durante a noite a quatro graus Celsius. Depois disso, lave duas vezes com TBST, com cada lavagem com duração de cinco minutos. Incubar com anticorpo secundário em TBST à temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, lave a membrana três vezes com TBST. Em seguida, misture volumes iguais de buffer ECL A e buffer B.Adicione essa mistura à membrana e incubar por um minuto. Cubra a membrana com plástico e exponha-a a uma película de raio-x à temperatura ambiente por dois a três minutos antes de desenvolver o filme.
Neste estudo, o eCLIP MOV10 em testículos de camundongos adultos com RNase I tratando o lisato interligado, a proteína alvo, que é de aproximadamente 114 kilodaltons, é enriquecida com sucesso. Os resultados qPCR do CDNA diluídos de 1 a 10 de várias amostras revelam que amostras não cruzadas mostram diminuição da recuperação do RNA. Observa-se que os valores ct do grupo não-transligado são geralmente cinco vezes mais do que o grupo UV-crosslinked.
Os resultados representativos para amplificação pcr e seleção de tamanho através da eletroforese de gel agarose são mostrados aqui. O produto primer-dimer aparece em cerca de 140 pares de base. A visão do Navegador de Genoma do UCSC de duas sequências de subclone representativas mostra que as tags eCLIP vinculadas a MOV10 estão localizadas dentro do UTR de três primes do gene Fto.
A taxa aproximada de metas UTR de três primes é consistente com a maioria dos alvos MOV10 em células HEK293 e em testículos. Em contraste, as tags eCLIP com destino a MOV10L1 estão localizadas dentro de um cluster piRNA, indicando que mOV10L1 tem como alvo os precursores do piRNA. A taxa aproximada das metas precursoras do piRNA representa 42% que refletem uma tendência de estudos anteriores.
MOV10L1 eCLIP com digestão RNase I de 40 unidades por mililitro produz relativamente mais sequências com menos de 20 pares de base. Este protocolo descrito aqui representa um emprego do método eCLIP na reprodução, uma área em que o conhecimento de interação RNA-RBP é bastante insuficiente.
