Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da epigenética, como a quantidade de modificações cromáticas que são reguladas de forma específica do tipo celular, juntamente com genomas. A principal vantagem desta técnica é que podemos isolar a cromatina das células-alvo e, em seguida, seguir cigano típico rio abaixo. Assim, este método pode fornecer insights sobre trimincil específico de neurônio, lysinc 4, opisoncilly.
Também pode ser aplicado a outras modificações de histona, outros tipos de células e, em seguida, outros organismos modelo. Demonstrando o procedimento será Mari Mito, técnica do meu laboratório. Para começar, use uma tesoura de mola fina para dissecar o tecido de interesse em pequenos pedaços.
Adicione os fragmentos de tecido a um recipiente limpo cheio de nitrogênio líquido. Em seguida, transfira os fragmentos de tecido para dois tubos mililitros cheios de nitrogênio líquido. Armazene os tubos a menos 80 graus Celsius por cinco minutos com a tampa aberta para evaporar o nitrogênio líquido.
Coloque os tubos contendo as amostras de tecido em um bloco de gelo de metal refrigerado. Em seguida, coloque uma bala de metal em um tubo de 1,5 mililitro e esfrie-a com nitrogênio líquido. Coloque a bala de metal gelada em um dos tubos de amostra.
Feche a tampa e coloque o tubo no suporte do tubo de um moedor criogênico. Imediatamente, mergulhe o suporte do tubo montado em nitrogênio líquido por um minuto. Insira o suporte do tubo congelado no externo do moedor criogênico.
E agite vigorosamente por 30 segundos, 60 vezes. Depois disso, desmonte o moedor criogênico, remova a bala de metal. E coloque o tubo em um refrigerador de amostra pré-refrigerado.
Armazene o refrigerador a 20 graus Celsius negativos por 15 minutos. Em seguida, adicione 900 microliters de 1%de formaldeído ao tubo e pipeta para misturar. Transfira a suspensão para um novo tubo de dois mililitros com 900 microliters de 1%de formaldeído.
Em seguida, fixe a suspensão por 10 minutos com rotação suave a 23 graus Celsius. Para parar a reação de fixação, adicione 100 microlitadores de 2,5 molares de glicina molar ao tubo. E centrífuga a 3.000 vezes gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Depois disso, descarte o supernatante. Adicione um mililitro de PBS ao tubo e vórtice para misturar. Centrífuga a 3.000 vezes gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Repita este passo de lavagem, mais duas vezes. Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de lise um à pelota e pipeta para misturar. Centrifugar o tubo por cinco minutos a 3.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernante.
Adicione um mililitro de tampão de lise dois à pelota e vórtice para misturar. Em seguida, centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe. Depois disso, adicione 800 microliters de tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio com coquetel inibidor de protease à pelota e pipeta para misturar.
Centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernante. Em seguida, adicione 500 microliters de tampão RIPA com coquetel inibidor de protease à pelota. Em seguida, centrifugar a suspensão por cinco minutos a 3.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius e descartar o supernaspe.
Adicione um mililitro de tampão RIPA com coquetel inibidor de protease. Imediatamente após adicionar tampão RIPA com coquetel inibidor de protease, transfira o lysate para um tubo sonicator. E coloque o tubo em um ultrassônico.
Usando as configurações descritas no protocolo de texto, tesoura a cromatina. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de baixa ligação de proteína de 1,5 mililitro. E centrifuá-lo por cinco minutos a 20.000 vezes gravidade a quatro graus Celsius.
Recolhe o supernasal da amostra e transfira-o para um novo tubo de baixa ligação proteica. Neste protocolo, foi introduzido e demonstrado o sequenciamento da imunoprecipitação de cromatina tandem. Durante o procedimento, a qualidade do DNA foi testada em várias etapas.
Imediatamente após a sônicação, o DNA cortado foi isolado e testado com máquina de eletroforese microfluida. Depois de usar anticorpo anti-FLAG e anticorpo anti-H3K3me3 para realizar a purificação de afinidade, a qualidade do DNA foi verificada novamente. A especificidade da purificação imunológica do DNA em H2B-FLAG foi confirmada com amostras de controle negativos.
Onde quantidades insignificantes de DNA foram detectadas. Mais adiante no protocolo, verificou-se a qualidade da biblioteca de sequenciamento. O chip e o T-ChIP bem sucedidos foram evidenciados através de análise de enriquecimento usando primers voltados para a região promotora do gene GAPDH.
Foram obtidas redistribuições representativas ao longo de três genes neurônios. E o enriquecimento das leituras nas cinco extremidades primos dos genes pelo neurônio T-ChIP busca sobre todo o cérebro T-ChIP busca foi observado. Após uma estabilização, essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo epigenético explorarem o tipo celular específico modificação de histona geral em neurônios em camundongos.
Não se esqueça que trabalhar com formaldeído pode ser extremamente perigoso e tomar precauções como usar roupas de borracha e óculos deve ser sempre tomado durante a realização deste procedimento.
