Sondas plurais excitáveis UV, têm uma contaminação inerente ao sinal, por causa dos sons auto-plurais. A maior parte do problema com o NADH é limitar o uso de uma sonda plural. Um método pode ser usado, para corrigir precisamente a florescence externa do NADH, a fim de extrair um sinal de sonda plural verdadeiro e não contaminado.
Demonstrando o procedimento estará Jeong Hoon Lee, nosso professor assistente de pesquisa do meu laboratório. Depois de permitir que os miócitos se acomodem no fundo do tubo, aspire o supernatante. Rotule as células com dois mililitros de solução de diluição de fura-2-FFAM recém-preparada por 60 minutos a quatro graus Celsius.
No final da incubação, coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos na posição vertical antes de remover o sobrenante. Em seguida, adicione quatro mililitros de cultura de temperatura ambiente para armazenamento à temperatura ambiente. Para in situ isobestic fura-2-ffa identificação ponto montar as células diluídas no estágio microscópio e esperar três minutos para que as células afundem até o fundo.
Profuse solução sem NADH sem cálcio de 37 graus Celsius na cultura celular e localize uma célula alvo. Solução de saponina profusa por 60 segundos antes de reformular com a solução livre de cálcio sem NADH. Meça simultaneamente os sinais emitidos fura-2-ff a 450 e 500 nanômetros, usando uma varredura de excitação de 350 a 365 nanômetros com um passo de 0,1 nanômetro e reaproveitamento com solução livre de cálcio sem NADH.
Em seguida subtraia os sinais na solução saturada de cálcio a partir dos sinais nas condições livres de cálcio. Em seguida, calcule os desvios padrão da emissão em cada excitação e selecione o comprimento de onda de excitação mostrando os valores mínimos de desvio padrão como pontos isobesticos individuais. Para usar um sistema de medição multi-paramétrico para detectar o sinal de fundo e corrigir o sinal dentro da área celular, monte células livres de corantes no banho de microscópio e permita que as células se acomodem por três minutos.
Profuse solução sem cálcio NADH no banho por cerca de cinco minutos a uma taxa de dois a três mililitros por minuto e defina o campo objeto para cobrir a célula alvo. Depois de mover a célula para fora do campo, meça os sinais de fundo da janela livre de células e defina os sinais como deslocamentos. Em seguida, devolva a célula à posição inicial e meça os sinais de fundo da célula e a área celular.
Para calcular o fator R use o fundo celular adquirido e os sinais de área antes de remontar as células livres de corantes ao microscópio e profusar com solução livre de cálcio. Meça os sinais como indicado antes de profusar a suspensão da célula com solução de malate. Depois de medir os sinais profuse as células com solução piruvato seguida de profusão com solução de malate-pirudo e solução rotenone.
Em seguida, calcule a inclinação para cada sinal. Aqui são mostradas as mudanças no cálcio mitocondrial antes e depois da correção. Os resultados revelam claramente mudanças substanciais no cálcio mitocondrial com uma concentração mitocondrial de cálcio de repouso sem cálcio citosolico de 1,03 mais ou menos 0,13 micromolar e cálcio mitocondrial máximo em um micromolar de cálcio de 29,6 mais ou menos 1,61 micromolar.
O potencial transmembrano mitocondrial foi monitorado com uma profusão de dois nanomolars TMRE. A mudança no potencial mitocondrial foi calculada com base em um suposto potencial inicial inicial de membrana mitocondrial de menos 150 milivolts, demonstrando uma diminuição do NADH em resposta à adição de cálcio, com um efeito negliável sobre o potencial da membrana mitocondrial. O pH mitochondiral não foi efetuado pelo aumento do cálcio mitocondrial induzido pelo carregamento carboxy SNARF-1.
Pontos isobesticos incorretos resultam em correção incorreta de R e NADH. Por isso, tome cuidado para medir sempre corretamente o fundo livre de células e a área celular. Esta técnica é usada para preparar estudos dinâmicos mitocondriais de cálcio nos derramamentos bioanalíticos.
