Name: nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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Este trabalho foi financiado em parte pelo DP2OD008470 concessão NIH. Além disso, RAM foi apoiado em parte por fundos fornecidos pela Universidade de Notre Dame Graduate School. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, o Centro de Zebrafish Research, e do Centro de Células Estaminais e Medicina Regenerativa na Universidade de Notre Dame. Agradecemos especialmente os membros do laboratório para envolver discussões sobre a biologia rim e seu feedback útil sobre este trabalho.

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Notre Dame. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Adicione uma solução de estoque de 50x E3 meios embrião por mistura de 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2, e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada, e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilui-se a solução 50x estoque de E3 estoque meios embrião para uma solução de trabalho de 1 x com água destilada, depois adicionar 200 mL de 0,05% de azul de metileno para cada uma L de 1x E3 para actuar como um fungicida, e armazenar a RT. </li><li> Adicione uma solução de bloqueio de pigmentação E3 meios embrião com 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) através da combinação de 40 ml de solução stock 50x E3 com 0,06 mg PTU. Em seguida, levar o volume a um total de 2 L com água destilada. </li><li> Agita-se a O E3 / PTU / N à temperatura ambiente para obter o pó PTU na solução. Em seguida, armazenar o E3 / PTU naRT. Nota: O E3 / PTU possui uma vida útil de aproximadamente uma semana, e as soluções mais antigas vai ser menos eficaz em bloquear o desenvolvimento de pigmentação em larvas de peixe-zebra. </li><li> Adicione uma solução anestésica de 0,2% tricaina (MS-222) por adição de 1 g de tricaina a 500 ml de água destilada e ajustar o pH a 7,2 com Tris 1 M, pH 9,5. </li><li> Prepare-se para fazer uma solução de metilcelulose a 2% para imagiologia por colocação de uma solução de 1x E3 (sem azul de metileno), com 1/10 do volume de 0,2% tricaina adicionado a 4 ° C. Nota: A solução de metilcelulose é uma solução de espessura, claro que é usado para estabilizar suavemente embriões vivos para microscopia. Depois de manipulações são realizados os embriões podem ser lavados em 1x E3 para dissolver a metilcelulose sem ferir o animal e permitindo a microscopia em fases posteriores na mesma amostra. </li><li> Quando arrefecida a 4 ° C, agita-se a solução 1x E3 / tricaina vigorosamente numa placa de agitação e adicionar gradualmente a quantidade apropriada de cloridrato depó de celulose, continuando a agitar vigorosamente. Gradualmente adicionar o pó à solução para prevenir a formação de agregados insolúveis de metilcelulose. </li><li> Depois que todo o pó é misturado na solução de metilcelulose / E3 / tricaina 2%, agita-se a solução de composto em 4 ° C, a sala de frio S / N. Nota: A temperatura fria é melhor para dissolver completamente o pó. Se a solução não for límpida após uma noite, agita-se durante um dia de trabalho adicional e / ou um segundo S / N. </li><li> Para remover as bolhas de ar a metilcelulose a 2% / solução / tricaina E3, aliquota-se a mistura em tubos de 1,5 ml e giram a alta velocidade (12.000 xg) a 4 ° C durante 30 min ou até 2 horas. </li><li> Coloque a solução / E3 / tricaina metilcelulose a 2% a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Nota: Antes do uso, alíquotas deve ser pré-aquecido até à temperatura ambiente para trabalhar com os espécimes de peixe-zebra. </li></ol> 2. Preparação de Ferramentas <ol><li> Prepare uma ferramenta embrião manipulador, usado para positioning embriões para microinjecção, anexando uma ponta de carga do gel na ponta de uma &quot;agulha de dissecação 5 linear e seguro com fita ou supercola. </li><li> Prepare agulhas microinjeção usando um extrator de agulhas, colocando primeiro um fogo polido 10 centímetros de vidro de borosilicato com filamento no instrumento e fixe o vidro de borosilicato, apertando os punhos. </li><li> Puxe o vidro de borosilicato de moda finas agulhas-cônicos. Utilize as seguintes definições: aquecer 540, puxe 245, velocidade 200 e 125 tempo. </li><li> Coloque as agulhas dentro de uma placa de Petri, suspendendo-os em uma tira de massa de modelar para proteger as pontas das agulhas, e manter o prato coberto para evitar o acúmulo de poeira. </li><li> Para terminar de preparar a agulha para microinjeções, use uma borda lâmina de barbear ou uma pinça fina para cortar o final puxou da agulha para criar uma ponta de injecção angular afiada com um diâmetro de cerca de 0,05-0,1 mm. </li><li> Para fazer com que o tabuleiro de microinjecção, preparar uma solução de 1,5% de agarose / E3 em um 100 ml frasco Erlenmeyer e dissolver a agarose por aquecimento a E3 a uma fervura num forno de microondas, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Verter a solução de agarose / E3 arrefecida para uma placa de Petri de fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Quando isso tiver solidificado derramar uma segunda camada com uma profundidade de aproximadamente 0,3 cm, e inserir o molde pré-fabricado e embrião bem permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente. Nota: Quando da inserção do molde para a camada / E3 de agar de topo, colocando o molde em agar em um ângulo para diminuir o número de bolhas de ar. </li><li> Quando a bandeja toda a microinjecção definiu, levante o embrião pré-fabricada bem moldar para fora lentamente e com cuidado usando um scoopula, em seguida, encher o prato com solução E3 e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação de Embriões <ol><li> Configurar tanques de acasalamento de peixe-zebra, colocando divisórias em câmaras de acasalamento e encha com água do sistema. </li><li> Coloque um peixe de cada lado da divisória such que cada câmara de acasalamento contém uma fêmea e um macho peixes, e cubra cada uma das câmaras de acasalamento. </li><li> Na manhã seguinte, retire os divisores para permitir a desova. </li><li> Verifique o peixe depois de aproximadamente 30 minutos, e depois de voltar os adultos para o aquário, recolher os seus embriões, passando a água do tanque de acasalamento por meio de uma ferramenta de filtro fino de arame. </li><li> Inverter a peneira sobre uma placa de Petri e enxaguar com E3 para recolher os embriões. </li><li> Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N. </li><li> Quando os embriões atingiram o estádio de 24-26 somito 26, decanta-se a maior parte dos meios de comunicação e, em seguida, E3 dechorionate por adição de 100 ul de 50 mg / mL de pronase para cada prato de embriões e incubando o prato à TA (23 ° C) durante aproximadamente 15 min. Nota: Vai levar cerca de 24-25 horas a partir do momento da fertilização para os embriões para chegar à fase 24-26 somite se forem recolhidas através do método descrito e incubadas O / N a 28,5 ° C. </li><li> Encha o prato comE3 e, em seguida, agite cuidadosamente para desalojar os córions dos embriões. </li><li> Decantar o E3 / pronase e lavar o prato com 25 ml de E3 fresco. Repita etapa de lavagem para remover toda a pronase. </li><li> Para bloquear o desenvolvimento da pigmentação, decantar o E3 e substituir com 25 ml de fresco E3 / PTU quando os embriões tenham atingido 24 horas após a fertilização. Nota: Para experiências abrangendo vários dias, substitua a solução E3 / PTU com meios frescos uma vez por dia para manter o prato limpo. </li></ol> 4. Solução de Microinjeção nefrotoxina <ol><li> No dia da injecção, preparar a solução nefrotoxina desejado, juntamente com o controlo de veículo apropriado. </li><li> Vortex ou misturar suavemente para assegurar a droga (s) é / são em solução, verificando os lados do tubo e o topo da coluna de água. Nota: As soluções nefrotoxina pode estar preparado para conter pequenas quantidades de dextrano conjugado fluorescente para monitorar a eficiência de microinjeção e também avaliar a depuração renal em subseqtempo uentes aponta 20,28. </li><li> Carregar uma agulha de microinjecção aparado com ~ 2-3 ul da nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fina na parte de trás da agulha e suspender a agulha na vertical, com um pedaço de fita para permitir que a solução para encher a extremidade da agulha cortada por gravidade. </li><li> Uma vez que a ponta da agulha está cheio, fixar a agulha carregada no micromanipulador. </li><li> Testar o volume microinjecção, colocando uma gota de óleo mineral para uma lâmina de micrómetro e injectar no óleo a avaliar o tamanho de gotícula. Um volume de injecção de 500 pl tem um diâmetro de 0,1 mm. </li><li> Remover o prato de embriões a partir do incubador, e anestesiar por adição de cerca de 5 ml de 0,2% tricaina ao prato embrião. </li><li> Para garantir anesthetization completa, tocar suavemente embrião com a ponta da ferramenta embrião manipulador. A falta de movimento indica anesthetization suficiente. </li><li> Após anestesia com sucesso, transferir embriões para o molde de injecção com um transfpipeta er. </li><li> Manobrar cada embrião dentro de um poço diferente do molde colocando a cabeça na área mais profunda do poço de tal forma que o tronco repousa ao longo da depressão e da cauda fura acima fora da depressão. </li><li> Inserir a agulha introduzida no micromanipulador e posicionar a ponta da agulha ao lado de um embrião. </li><li> Gentilmente inserir a agulha para dentro do vaso cauda movendo o joystick para a frente e pressionar o pedal para entregar a microinjecção. Nota: injeção de sucesso pode ser medido observando o líquido entra na circulação. Além disso, a co-injecção do nephrotoxicant com dextrano conjugado por fluorescência permite que o pesquisador para verificar a injecção subsequente de sucesso para o procedimento. </li><li> Gentilmente puxe o joystick para remover a agulha do embrião. </li><li> Após a injeção, transferir os embriões para um prato limpo e lavar para remover o tricaina e substituir com frescos E3 / PTU. </li><li> Incubar o embrião para o ponto de tempo desejado para avaliars morfologia, a qual pode ser documentadas por fotografia em meios de montagem de metilcelulose, ou um processo para a análise experimental como desejado. Nota: Recuperação de embriões devem ser avaliadas para determinar a percentagem de indivíduos com edema, que normalmente indica lesão renal. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA 29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido 30 e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado 31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas droga...

LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde 1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% 1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e 4 fármacos quimioterapêuticos. LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central 1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas 1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal 1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica 1. Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a 5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação 7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise 8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI 8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI. A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI 10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas 11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos 13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios 17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade 20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como 22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos 25. O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina &lt;sup&gt; 25, em que o método de microinjecção 20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf 26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;(microinjection tray) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

Os rins são suscetíveis a danos causados ​​por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados ​​para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.

Uma estação de microinjecção configurar inclui um estereomicroscópio, micromanipulador e regulador de pressão (Figura 1A). Transiluminação da placa de injecção é preferível para visualizar amostras durante este procedimento (Figura 1B). Preparação da agulha de injecção implica puxar o vidro de borosilicato apropriado, seguida por preparação da borda de corte e, finalmente, com back-carregar a agulha. Optimamente, a ponta da agulha é ch...

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.8K visualizações.  University of Notre Dame.  lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Microinjeção intravenosa de nefrotoxinas em embrião de peixe-zebra: uma técnica para administrar agentes nefrotóxicos na corrente sanguínea de embriões de peixe-zebra

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...