This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca 2+ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca 2+ intracelular sinais em muitos tipos de células 8-10. 1. Preparação de células <ol><li> Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor. </li><li> Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina. </li><li> Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro e as células em pratos de semente de imagem de fundo de vidro, a uma densidade de 3-7 x 10 4 culas por prato. Selecione as células para experimentos com imagens quando chegar a 60% de confluência (2-3 dias). </li></ol> 2. Preparação de Soluções e Reagentes <ol><li> Prepare uma CA 2+ molecular contendo tampão HEPESsolução de sal de (Ca 2+ -HBSS) composto por (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, e 10 de glucose; pH = 7,4 à temperatura ambiente (TA) com NaOH. Prepare Ca 2+ -HBSS sem a adição de glicose e armazenar a 4 ° C; adicionar a solução de glicose imediatamente antes da utilização. </li><li> Solubiliza-se formas de membrana permeante do Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP 3 (200 uM), e EGTA (100 mM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) contendo 20% de Pluronic F-127. Alíquota estes reagentes em tubos Eppendorf e armazenamento, protegido da humidade e da luz, à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 3. Carregando Cells com uma membrana de permeant Cal-520, ci-IP 3 e EGTA <ol><li> Preparar o &quot;tampão de carga&quot; diluindo soluções de reserva de permeante da membrana Cal-520 e ci-IP 3 até uma concentração final de 5 uM e 1 uM, respectivamente, em Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspirar cumedia LTURE e lavar as células através da substituição de mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. </li><li> Remover Ca 2+ -HBSS e incubar as células em tampão de carga, durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover tampão de carregamento e enxaguar células, substituindo mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. <ol><li> Se desejado, nesta etapa, as células de carga com EGTA / AM por diluição da solução de reserva até uma concentração final de 5 uM em Ca 2+ -HBSS e, em seguida, as células incubar durante 30-60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após esta incubação, lavar as células três vezes com Ca 2+ -HBSS antes de prosseguir para o passo 3.5. </li></ol></li><li> Incubar as células em Ca 2+ -HBSS durante 30 min para permitir a desesterificação de reagentes carregados. </li><li> Imediatamente antes de imagem, substitua Ca 2+ -HBSS com &quot;fresco&quot; Ca 2+ -HBSS, a fim de remover qualquer corante que pode ter vazado para o banho durante a incubação final. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Aquisição de Imagem <ol><li> Coloque uma pequena gota de óleo de imersão para o objetivo 100X APO TIRF (NA 1,49). </li><li> Montar o prato de imagem na fase do microscópio invertido e trazer as células em foco utilizando luz transmitida. É importante proteger o prato de imagem para impedir o movimento durante a gravação. </li><li> Iluminar as células com um laser de 488 nm, a fim de excitar Cal-520 e recolher a fluorescência emitida (λ&gt; 510 nm) usando uma câmara EMCCD alta velocidade. NOTA: O pacote de software que opera o microscópio permite ao utilizador para traduzir uma lente de focagem, permitindo que o feixe de laser a ser introduzido quer no bordo extremo da abertura traseira objectivo (por excitação TIRF) ou mais centralmente (para a excitação &quot;WF&quot;). </li><li> Usando o software EMCCD, reduzir o campo de imagem a partir da plena 512 x 512 pixels, a fim de coletar dados na resolução temporal necessário para capturar Ca 2+ eventos locais. NOTA: Por exemplo, quad centeraquisição de 256 x 256 pixels acelera a taxa de aquisição de 66 fps. Também é possível aumentar ainda mais a taxa de quadros da câmera EMCCD para 500 fps usando uma função Modo de recorte isolado. </li><li> Configure o software para gravar automaticamente alguns segundos de atividade basal, entregar um flash UV para as células e continuar a gravação para outra 10-30 seg. NOTA: Um lampejo de UV é entregue utilizando uma fonte de luz de arco de xénon introduzido através de um espelho dicróico UV reflectindo na porta traseira do microscópio. A duração e intensidade do lampejo de UV é ajustado empiricamente para evocar uma frequência desejada de Ca 2+ acontecimentos locais. </li><li> Salvar arquivos como imagem pilhas para análise off-line. </li></ol> 5. Automated Ca 2+ Análise Imagem NOTA: É possível visualizar, processar e analisar dados capturados usando muitos pacotes de software comerciais. No entanto, temos desenvolvido um algoritmo para automatizar rapidamente uma identificaçãod análise de Ca 2+ sinais locais. Uma descrição detalhada dos filtros espaciais e temporais utilizados neste algoritmo, a geração dos Af / F 0 e identificação / rotinas de análise pode ser encontrado em 11. Este algoritmo foi desenvolvido para rodar na plataforma Python software open-source, e pode ser obtido, juntamente com a amostra de dados experimentais e instruções detalhadas de usuários, pelo autor correspondente e-mails (ismith@uci.edu). <ol><li> Converta arquivos a serem importados para o algoritmo escrito sob medida para o formato de arquivo multi-plano .tiff. </li><li> Localize a pasta que contém o algoritmo de análise e dê um duplo clique no run.exe. </li><li> Selecione o arquivo .tiff a ser analisado. </li><li> Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Veja a Figura 2A para parâmetros padrão para os dados de exemplo. </li><li> Determinar o nível de preto para ser deslocada da pilha pela imagem seja movendo o cursor para uma parte do campo de visão que n fazot conter uma célula (ver Figura 2B) ou digitando manualmente um nível de preto usando o prompt de &#39;Black Nível Definir&#39;. </li><li> Observe quatro janelas na tela seguinte análise pelo software (Figura 2C-F). C é uma imagem monocromática de descansar fluorescência a partir de células que está sendo analisado. Quadrados brancos sobrepostos na imagem são os locais de evento, determinados como as posições centróide funções de Gauss bidimensionais que equipam os eventos. </li><li> Clique em cada local do evento ou pressione as teclas do cursor para navegar entre os eventos. Ao fazê-lo a subtracção do fundo, Gaussian alisou mudanças de relação de fluorescência (Af / F 0) em cada um desses sites de atualização na janela D. NOTA: Red destacou os acontecimentos estão determinados a se originam de que determinado site e não de &quot;sangrar-through &#39;de atividade localizada para locais adjacentes. O traço azul mais baixo indica que o sinal de fluorescência no local seleccionado excedeu a detecçãolimiar, enquanto que a linha preta identifica eventos provenientes desse local particular (que corresponde ao vermelho eventos realçado). </li><li> Clique sobre um evento vermelho destaque para actualizar a janela E que mostra a evolução temporal do evento, e a janela F, que mostra o perfil espacial do evento, calculados sobre o curso de tempo, em conjunto com o perfil espacial da função de Gauss ajustada. </li><li> Manualmente todos os eventos que foram identificados para que os artefatos podem ser rejeitada de análise. Excluir tais eventos clicando o botão direito no vermelho destacou os acontecimentos. NOTA: Em nossas mãos, fluxo de Ca2 + através dos canais individuais IP 3 R evoca sinais com Af / F 0 cerca de 0,11, então é provável que sejam falsos positivos quaisquer &#39;eventos&#39; detectados sensivelmente menores do que isso. </li><li> Exportar dados Ao selecionar &#39;Salvar em Excel &quot;ou exportação de dados em uma base por célula desenhando em torno da célula de interesse e selecionando&quot; Salvar CellR17 ;. NOTA: Os dados são salvos na mesma pasta que a pilha de imagem original. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca 2+ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 + sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficien...

Os íons de cálcio (Ca 2+) ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica 1. Uma maneira através da qual Ca 2+ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca 2+ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca 2+] contração gatilho no tecido muscular liso 2 Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca 2+ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória 3 gene. Citosólico livre [Ca 2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 + no citosol através de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 + a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 R), que forma um canal de Ca2 + de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos IP3 e Ca 2+ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R 3 se abre para libertar o Ca2 + sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 + pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP 3 Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 + (Ca2 + sopro 4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP 3 Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 + induzida por Ca2 + -release (CICR) 5,6. A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca 2+ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien 7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca 2+ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca 2+ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em&gt; 500 quadros seg -1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca 2+ eventos canal 8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos. 2+ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de Ca2 + eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI 3 -generated Ca 2+ sinais, eles são facilmente recuperáveis ​​para estudar alterações locais na citosólica [Ca 2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares 8-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Citossólica Ca 2+ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca 2+ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca 2+ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca 2+ microdomínios (Ca 2+ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de 2+ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros&gt; 500 s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca 2+ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local 3 mediada por Ca 2+ sinais em células de mamíferos intactos carregados com Ca2 + indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca 2+ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca 2+ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP 3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP 3 suscitou transientes de Ca2 + puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP <s...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

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JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K visualizações.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.