We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. Preparação de Mídia, Reagentes e Condições de cultura celular <ol><li> Humano HEK 293 células de rim embrionário <ol><li> Culturas células HEK 293 (CRL-1573, ATCC) em meio F-12 DMEM / Ham suplementado com 5% de FCS, L-glutamina (2 mM) e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 ug / mL). </li><li> Para passagem, as células, lave as células uma vez com PBS, adicionar 0,05% de tripsina / EDTA e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Transferência de células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g) e transferir cerca de 5x10 5 células em um frasco de cultura T25 fresco. </li></ol></li><li> Fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) <ol><li> Adicionar 1 ml de uma solução de gelatina a 0,1% a cada 6 poços e incubar à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. Aspirar líquido e armazenar a RT até o uso. </li><li> Cultura MEFs em DMEM suplementado com 10% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glicose (4,5 g / l), piruvato de sódio (1 mM) e penicilina (100 U /ml) / estreptomicina (100 ug / ml) em placas de 6 poços revestidos com gelatina. </li><li> Distribuir MEFs em placas de 6 poços e deixá-los crescer até confluência. Adicionar mitomicina (5 ug / ml) durante 2,5 horas para reter as células. Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com meio completo e MEF adicionar 3 ml de meio para cada MEF de 6 poços. Estas células servir como uma camada de alimentação para as células iPS murino e suína. </li></ol></li><li> Cultura do ES murino e células iPS <ol><li> Para preparar rato ES meio de cultura, suplemento de meio DMEM com FCS 15%, L-glutamina (2 mM), L-glicose (4,5 g / L), aminoácidos não essenciais MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) e factor inibidor de leucemia (1.000 U / ml). </li><li> Lavar 6-poços com MEFs preso-crescimento uma vez com DMEM isento de soro, adiciona-se 2 ml de rato ES meio e as células iPS de murino (20% das células de um prato confluente). A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro e adicionar 2 ml do rato fresco médias ES. </li><li> Para passagem, as células, lavar cada poço uma vez com DMEM isento de soro, adicionar 00,25% de tripsina / EDTA e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Células transferir para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g), Ressuspender as células em 500 ul de rato meio ES e adiciona-se 100 ul da suspensão a 2 ml rato meio ES num fresco de 6 poços com um MEF feeder-layer. </li></ol></li><li> Cultura de células iPS porco <ol><li> Para preparar porco meio IPS, complementar DMEM / Ham F-12 com 20% de soro de nocaute, L-glutamina (2 mM), aminoácidos não essenciais MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 ug / mL). Filtrar através de um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C durante 2 a 3 semanas. Após a primeira utilização, adicionar bFGF (10 ng / ml concentração final). </li><li> Lavar 6-poços com MEFs preso-crescimento uma vez com DMEM isento de soro / F-12 e adicionar 1,5 ml de porco iPS médias de Ham e suína células iPS (10% das células de um prato confluente). A cada dia Lave as células uma vez com DMEM isento de soro / F-1 de Ham2 e adicionar 1,5 ml de suíno fresca médias iPS. </li><li> Para preparar tampão de dissociação adicionar 2,5% de tripsina, colagenase IV (10 mg / ml), soro nocaute (20%) e CaCl2 (1 mM) ao Ca2 + livre de PBS. Lavar as células duas vezes com PBS e incuba-se com tampão de dissociação durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Células transferir para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g). </li><li> Ressuspender as células iPS porcinas em 500 ul de meio fresco porco ips e adicionar 50 ul de suspensão a 1,5 ml de meio de porco iPS num fresco de 6 poços com um alimentador de camada MEF. A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro / de Ham F-12 e adicionar 1,5 ml de suíno fresca médio iPS. </li></ol></li><li> Cultura sem alimentador de células iPS humanas <ol><li> Descongelar o recipiente original contendo a preparação de membrana basal a 4 ° C e dilui-se com DMEM isento de soro, arrefecido em gelo / F-12 para 8 mg / ml, e alíquotas de Ham armazenamento a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> Descongelar uma aliquota da basepreparação de membrana mento a 4 ° C e diluir com DMEM / F12 gelado isento de soro de Ham (90 ug / mL). Pipete 1 ml desta solução em 3 cm placas de cultura e agitar suavemente para assegurar que toda a superfície é coberta. Selar pratos com parafilme e armazenar a 4 ° C por até uma semana. Antes do uso para cultura de células incubar os pratos durante 30 min a 37 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente para permitir que a polimerização da preparação da membrana basal. </li><li> Aspirar o meio a partir de placas revestidas com a preparação da membrana basal e lavar duas vezes com DMEM isento de soro / de Ham F-12. Adicionar 1,5 ml de meio E8 para o prato de cultura e as células humanas do iPS (10% das células de um prato confluente). A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro / F-12 e adicionar 1,5 ml de meio fresco E8 de Ham. </li><li> Para a passagem das células, lavar pratos duas vezes com PBS e adicionar 1 ml PBS / EDTA 0,5 mM. Incubar os pratos durante 5 min à TA. Monitorar as células em um microscópio. Nota: Quando as colônias começam a arredondar para cima e appear para ter buracos que eles estão prontos para transferência. </li><li> Aspirar o líquido, adicionar 1,5 ml de meio E8 e retirar células cuidado pipetando para cima e para baixo. Transferência de células para um tubo de 15 ml, centrifuga-se durante 5 min a 1.200 rpm (300 x g), ressuspender em 500 ul de meio E8 e adicionar 50 ul de suspensão a 1,5 ml de meio E8 em um prato de cultura fresca revestida com a preparação da membrana basal . </li></ol></li></ol> 2. Projeto de target-sequências entre espécies Borders <ol><li> Selecionar humano de referência, murino e sequências de cDNA suína dos genes-alvo (GAPDH, NANOG, GDF3) e realizar uma análise de alinhamento multi-seqüência CLUSTAL. Nota: Este indicará as sequências homólogas entre as espécies. <ol><li> Use as seguintes configurações para alinhamento múltiplo: penalidade de lacuna (fixa) 10, penalidade de intervalo (variando) 5, a transição de ponderação 0, gama gap pena de separação 8,% de identidade por atraso 40, número máximo de iterações para executar 3. </li></ol></li><li> Enviar sequências alvo desejados com o fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para o projeto da sonda e de fabricação. Nota: O fabricante, então, confirmar a compatibilidade de sequência desejada com a tecnologia. Se sequência desejada não for compatível, o fabricante irá sugerir seqüências alternativas. <ol><li> Assegurar que as regiões homólogas que podem ser utilizados como potenciais sequências de captura de cadeia tem um comprimento de 27 pb. Nota: É aconselhável hora vários nanopartículas com diferentes cadeias de captura para um gene alvo seleccionado como só a experiência celular verdadeiro irá dar uma prova definitiva da funcionalidade de uma sequência individual. Portanto, duas sequências diferentes para GAPDH e GDF3 foram avaliadas enquanto três diferentes nanopartículas foram testados para avaliar a expressão de NANOG. A sua localização e as sequências exatas já foram publicados 17. O fabricante produz comercialmente o nanopartigos com sequências desejadas e fornece-los em formato liofilizado. </li></ol></li></ol> 3. Reconstituição dos Nanopartículas e Adição de culturas de células <ol><li> Armazenar nanopartículas liofilizados aquando da recepção a 4 ° C no escuro. </li><li> Reconstituir nanopartículas por adição de 50 uL de água duplamente destilada que dá uma concentração final de 100 nM. Uma vez reconstituído armazenar nanopartículas à TA no escuro. Nota: Sob esta condição são estáveis ​​durante pelo menos um ano. O armazenamento de amostras reconstituídas a 4 ° C, pode afectar negativamente a sua estabilidade. </li><li> Pré-diluir a solução de estoque de nanopartículas com PBS a uma concentração de 2 (células HEK 293) ou 8 nM (IPS e células ES) no dia da aplicação. Nota: Esta concentração é 20 vezes mais elevada do que a concentração final na placa de cultura. Em células ES e células iPS, 400 pM de nanopartículas induziu um sinal fluorescente facilmente detectáveis ​​ao microscópio. Para células HEK 293, AConcentration de 100 pM é suficiente. </li><li> Pipetar 12,5 uL de nanoparticulas pré-diluído para uma 237,5 ul de meio de cultura celular completo, contendo 24 poços. Para poços de tamanhos diferentes, ajuste os volumes em conformidade. Agitar a placa cuidadosamente para assegurar a igualdade de distribuição das nanopartículas. Incubar as células durante a noite (O / N) a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. </li><li> No dia seguinte análise de culturas de células específicas do gene Cy3 de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 546 nm (emissão de 575-640 nm) em um microscópio de fluorescência. Nota: O período necessário para obter uma fluorescência suficientemente forte pode depender do tipo de célula e o gene alvo. Nestas experiências, isto foi observado entre 16 e 20 horas após a aplicação da sonda. </li></ol> 4. Identificação de Cy3 positivos populações de células por citometria de fluxo <ol><li> Crescer HEK 293 ou células-tronco embrionárias de murino utilizando as condições especificadas no ponto 1.1 ou 1.3, respectively. Um dia antes da análise FACS adicionar GAPDH nanopartículas especï¿½icos a diferentes concentrações de células HEK 293 (ver Figura 6A) e de 400 pM para as células ES murinas. Incubar as células O / N a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. </li><li> Analise de culturas de células de fluorescência induzida por Cy3 específico do gene sob um microscópio de fluorescência. </li><li> Retire HEK 293 células como especificado no ponto 1.1.2. Centrifugar, transferir para um tubo de 1,5 ml e ressuspender em 200 ul de PBS gelado / BSA a 0,5% / (tampão FACS) 2 mM de EDTA. Manter células escuras em gelo até à análise por citometria de fluxo. </li><li> Retire células-tronco embrionárias de murino, conforme especificado no ponto 1.3.3. Centrifugar, transferir para um tubo de 1,5 ml e ressuspender em 200 ul de PBS gelado / BSA a 0,5% / EDTA a 2 mM. Manter células escuras em gelo até à análise por citometria de fluxo. </li><li> Pressionar as células através de um filtro de 30 | iM para prevenir a agregação celular e adiciona-se iodeto de propídio (concentração final de 2 ug / ml) 2 minantes da análise FACS para excluir as células mortas. </li><li> Para analisar as células Cy3-positivos primeiro set portões hierárquicos sobre o FSC-A / SSC-Um subconjunto, o FSC-H / FSC-W-subconjunto ea SSC-H / SSC-W subconjunto. Use a frente e para a dispersão lateral para excluir restos celulares e células que não são dispersas. Excluir células mortas pela sua coloração com iodeto de propídio exibindo PE contra PE-Texas Red. Execute o portão tipo final sobre células positivas Cy3-PE (Figura 4). </li></ol>

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HL recebeu as nanopartículas de EMD Millipore Corporation gratuitamente. Todos os outros autores não têm nada a divulgar.

O presente trabalho descreve a utilização de fluorescência marcado nanopartículas que permitem a avaliação fiável da expressão do gene intracelular directamente em células vivas a partir de diferentes espécies de mamíferos com origem diversa histogenética sob um microscópio de fluorescência. Esta abordagem tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos publicados. Em primeiro lugar o pesquisador não está limitado no que respeita quer o gene alvo ou tipo de célula. Todos os métodos de detecção de anticorpos com base estão restritos a um único epítopo. Embora balizas moleculares fluorescentes podem também ser concebidos para uma ampla gama de genes, este método requer a dissociação das células e subsequente nucleofection 15. Em contraste, a aplicação de nanopartículas específicos do gene não necessita de qualquer manipulação da célula alvo que engole as nanopartículas activamente por endocitose. Durante a passagem em subsequente as partículas de ouro gradualmente deixar as células e a cultura pode ser utilizado em downstream experimentos. No entanto, a tecnologia ainda também tem algumas limitações. Alguns marcadores não são obviamente detectável devido à sua natureza de hidrato de carbono, tais como SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actualmente, uma grande variedade de nanopartículas está disponível comercialmente. Estas partículas foram pré-testados para a sua funcionalidade nas experiências celulares. O objetivo do presente trabalho foi a concepção de sondas personalizadas que podem ser usados ​​em toda espécie fronteiras. Ao seguir essa abordagem ou ao projetar uma sonda para uma novela um gene-alvo tem que estar ciente de que a funcionalidade de um in silico previu sonda precisa de ser cuidadosamente avaliada in vitro. A sonda NANOG-SF3 que mostrou 100% de homologia com a homologia de sequência não funciona em todos, enquanto NANOG-SF1 com uma base de descasados ​​no murino e sequência de suíno produzido um sinal de fluorescência agradável. Outra questão refere-se à captação eficiente das nanopartículas. As partículas entraras células por endocitose, um processo que é influenciado pelo tamanho das nanopartículas 21, o tipo de célula e do estado de diferenciação 22, e a capacidade celular para realizar a phago- macropinocitose e 23. A concentração óptima para obter um sinal de fluorescência satisfatório tem de ser testado para cada aplicação individual ou linha de células. Para esse fim, o primeiro ensaio, devem sempre ser a aplicação de controlo da absorção de avaliar a compatibilidade das sondas dentro dos tipos de células e condições de cultura antes de passar para a detecção alvo específica da expressão do gene. Um ponto crítico para se obter resultados confiáveis ​​quando se aplica este protocolo para uma linha celular romance ou população de células é a inclusão de controles adequados. O controle de absorção fluorescente nunca irá fornecer uma sugestão de que as concentrações de nanopartículas irá induzir um sinal de fluorescência suficiente na população de células alvo. A fluorescência deve ser avaliard o próximo dia como o sinal vai desaparecer com o tempo 17. Ao mesmo tempo, o controlo de precipitação sem um homólogo no genoma eucariota aplicadas numa concentração idêntica deve induzir um sinal de fundo negligenciável. Como um terceiro controlo, é aconselhável usar uma nanopartícula específica para um gene de manutenção (por exemplo, de GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas servir como um controlo positivo que a abordagem pode ser utilizada para detectar a expressão de genes específicos na população de células alvo seleccionada. Se esses controles acabam por um satisfatório pode esperar para obter sinais fluorescentes específicos confiáveis ​​usando nanopartículas específicas para outros genes-alvo. A concentração das nanopartículas podem também ser aplicados como crítico que foram mostrados para regular negativamente a sequência alvo 24. No entanto, este efeito requer concentrações muito mais elevadas (5 nM) do que as concentrações utilizadas nas experiências aqui (400 pM) apresentados. A esta concentração o nanoflares não afectam ARNm do gene alvo ou os níveis de proteína e as concentrações tão elevadas como 2 nM não prejudicam a proliferação de células HEK293 e células ES murinas 17. Além disso, uma análise da expressão do genoma inteiro não revelaram quaisquer alterações significativas na expressão do gene 25. Portanto, a concentrações de 1 nM até os nanoflares não deve apresentar quaisquer efeitos adversos importantes. Uma aplicação muito promissora desta tecnologia é a possibilidade de marcar qualquer população celular dado que é marcada por um gene específico. Recentemente, nanopartículas específicos do gene têm sido usados ​​com sucesso para corar seletivamente miócitos ventriculares ao vivo 26, subpopulações de células de melanoma 27, monócitos e células 28 cerebelar culturas 29. Tais populações de células marcadas por fluorescência, pode ser ordenada e purificou-se por citometria de fluxo como células vivas. No campo da oncologia é imaginável para isolar células tumorais metastáticas vivo em modelos animaiscom base na sua expressão de CEA, mais valiosa para a pesquisa do potencial de metástase promover genes ou estruturas-alvo. Mostrámos recentemente que verdadeiramente reprogramadas iPS colónias murinas podem ser identificados in situ com nanog nanopartículas especï¿½icos com base na intensidade de fluorescência detectada 17. Portanto, a identificação de colónias iPS verdadeiramente reprogramadas poderia ser realizada em plataformas de alto rendimento, que utilizam detecção de fluorescência robotizada apanha e dispositivos para identificar as colónias mais promissores. Esta tecnologia parece ser adequado em muitas áreas de investigação para seleccionar subpopulações celulares específicas e parece possível aplicar as nanopartículas em plataformas rendimento elevados. Em conclusão, este protocolo representa uma nova abordagem de fluorescência utilizando nanopartículas marcado que permite a detecção da expressão do gene intracelular directamente em células vivas. Esta tecnologia pode ser uma ferramenta valiosa para purificar, expandir e mais personagemize subpopulações celulares raras em muitas áreas de investigação.

Em 2006, uma nova abordagem foi descrita para reprogramar células somáticas para um estado pluripotente. Depois prescreening de uma série de fatores de reprogramação potencial fibroblastos de murino pode ser convertido com êxito para as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por transdução retroviral e superexpressão de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efetivamente foi reproduzido com células somáticas de diferentes espécies de mamíferos, incluindo os seres humanos 2, 3 macacos, ratos, cães 4 5 6, ovelhas e porcos 7. Além disso, os protocolos modificado omitindo ou substituir o factor de transcrição de c-MYC potencialmente oncogénica foram publicados 8, 9. Independentemente da reprogramação inicial aproximar o verdadeiro pluripotência das colónias em crescimento tem de ser confirmada, uma tarefa trabalhosa e demorada. Uma grande desvantagemda maioria destas análises é que eles não podem ser realizados em células vivas. Factores de pluripotência estabelecidos, tais como OCT4, SOX2, NANOG ou Rex1 representam factores de transcrição localizados no núcleo e a sua detecção requer a fixação das células antes da sua imuno-histoquímica ou a lise das células por análise de RT-PCR 10 -. 12 Em seguida, estas células são perdidas para futuro experimentos que requerem culturas réplica de cada colônia. Assim, uma tecnologia para analisar pluripotência em células vivas é altamente desejável. Várias abordagens podem, efectivamente, ser realizada diretamente sobre as células vivas utilizando anticorpos dirigidos contra antigénios de membrana à base (por exemplo. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente relatado corantes para detectar 13 ou fosfatase alcalina moléculas pequenas que etiqueta especificamente estaminais embrionárias (ES) e células iPS 14. No entanto, os anticorpos podem, no entanto, afetar negativamente as células e cada methOD é restrito a um único marcador pluripotência. Finalmente, beacons moleculares fluorescentes, os oligonucleótidos anti-sentido com dupla-estruturas em gancho de cabelo, que permitem coloração vivo de células, têm sido descritos 15. Embora esta abordagem pode ser aplicada a muitos genes, a técnica requer nucleofection de uma suspensão de células individuais, que não é aplicável às crescentes iPS colónias. Um par de anos atrás nanopartículas específicos do gene têm sido descritas para analisar a expressão de survivina em células de câncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito descreve uma abordagem inovadora romance para detectar marcadores de pluripotência em ES vivos e células iPS através da utilização de conjugados de nanopartículas de ouro. Estas nanopartículas consistem de um centro de partículas de ouro com uma mecha de captura acoplados transportando a sequência de ARN complementar e um fio repórter marcado com Cy3. O sinal de fluorescência do fio repórter é extinta pela partícula de ouro central. Além disso, adequadonanopartículas servem como controlos negativos e positivos, respectivamente (Figura 1). Para uma aplicação das nanopartículas são simplesmente adicionados ao meio de cultura (Figura 2) e entram nas células através de endocitose (Figura 3). Se o RNA alvo é expresso que desloca a cadeia repórter que, em seguida, emite-se um sinal fluorescente. Este método não requer manipulação da célula alvo e a expressão do gene alvo pode ser monitorizado opticamente sob um microscópio de fluorescência directamente em células vivas. Além disso, a tecnologia pode ser aplicada a qualquer gene alvo desejado entre espécies no caso de células iPS e, assim, podem ser empregues em muitas áreas de investigação diferentes. Finalmente, análises de citometria de fluxo permite a identificação e o enriquecimento de células positivas Cy3.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

Em uma primeira tentativa de verificar e determinar a detecção intracelular de expressão de genes específicos em células vivas usando nanopartículas decidimos realizar experiências-piloto usando um gene de manutenção da casa constitutivamente expresso (GAPDH) em HEK 293 humanas células. A concentração das nanopartículas utilizadas nestas experiências foi escolhido de acordo com a recomendação do fabricante. A adição de uma sonda GAPDH especï¿½ico para o meio de cultura a uma concentração final de 100 pM induziram uma clara Cy3 fluorescência nestas células que era visível sob um microscópio de fluorescência após incubação O N / (Figura 5A). Dois controles foram incluídos nesses experimentos para comprovar o resultado. Um controlo compreende de um assim chamado nanopartícula &quot;precipitação&quot; onde a cadeia repórter não tem uma sequência correspondente em células de mamífero ou eucarióticas. A nanopartícula &quot;corrida&quot; determina a fundo inespecífica fluoresce devido à possível degradação da sonda ou extinção incompleta da fluorescência. A adição da sonda de precipitação produziu um único sinal fluorescente marginal, o que é negligenciável (Figura 5B). Um fluorescente permanentemente controlo &quot;captação&quot; ajuda a determinar a capacidade das células para incorporar as nanopartículas por endocitose que pode variar entre diferentes tipos de células. Estas partículas de controlo positivo produzido um sinal fluorescente brilhante em células HEK 293 (Figura 5C). Assim, a viabilidade da tecnologia para gravar um sinal de fluorescência específico de um gene intracelular com um sinal de fundo negligenciável foi confirmada. Deve ser mencionado que a diferença entre o sinal e o fundo de fluorescência específica diminui ao longo do tempo. O fundo aumenta devido a sondar a degradação ou a têmpera incompleta enquanto a fluorescência específica diminui gradualmente (Figura 5D). Os mesmos têm as nanopartículas especï¿½icos GAPDHfoi testada em culturas de fibroblastos primários de murino, porcino e ovino origem 17. Estas células produzem um sinal de fundo muito mais elevada do que as células REH 293, enquanto a fluorescência específica do alvo é bastante fraca, possivelmente devido à relativamente baixa capacidade proliferativa destas culturas. Estas experiências piloto levou-nos a utilizar esta tecnologia para a detecção da expressão do gene em pluripotência iPS derivadas de espécies diferentes. Para este efeito, GDF3 NANOG e foram analisadas, ambos os quais são conhecidos por serem expressos em células pluripotentes 18. No células iPS derivadas de fibroblastos primeiros cauda-ponta de um Nkx2.5 potenciador cardíaca linha camundongo transgênico 19 foram investigados. Para ambos os genes de um sinal fluorescente forte foi obtido (Figura 6A) e uma insignificante Cy3 fluorescência do controle de precipitação (dados não mostrados). Resultados semelhantes foram obtidos em células iPS humanas e suína (Figura 6B e C). É importante ressaltar que o sinal de fluorescência foi restrito às colônias iPS e não rotular os fibroblastos usados ​​como uma camada alimentadora para rato e iPS suína (ver setas na Figura 6A e C). A análise da expressão do gene NANOG revelou também que nem toda sequência prevista in silico ser &quot;boa&quot;, finalmente, é funcional. Um dos três designs de um NANOG nanopartículas especï¿½icos induzidas quase nenhum sinal de fluorescência comparável à do controlo de precipitação, apesar de uma sequência de jogo 100% em células iPS de murino (Figura 6D). Um resultado similar foi obtido em iPS células de origem humana e de origem porcina com esta sonda (dados não apresentados). Assim, as nanopartículas podem ser utilizados para detectar a expressão do gene através da espécie pluripotência fronteiras enquanto a funcionalidade de cada sonda concebida deve ser avaliado de antemão. Os resultados promissores da in siturotulagem de células vivas em pratos de cultura de células levou-nos a analisar a expressão do gene quantitativamente por citometria de fluxo. Para este fim GAPDH nanopartículas especï¿½icos foram adicionados em concentrações graduadas de células HEK 293 monocamadas, a fim de comparar a eficiência de marcação dentro da população de células alvo. Como avaliado por microscopia de fluorescência induzida por uma fluorescência aumentada Cy3 foi observado com a concentração mais baixa em comparação com as células que não receberam as nanopartículas. O aumento das concentrações de nanopartículas induziu um claramente dependente da concentração de fluorescência de células HEK 293 in situ (Figura 7A). Sujeitar estas células a uma análise por citometria de fluxo confirmou a eficiência de marcação dependente da concentração. A frequência de células positivas Cy3 aumentou significativamente (mais do que sete vezes) quando a concentração mais elevada de nanopartículas foi aplicado (Figura 7B). Em novos experimentos células-tronco embrionárias a partir da cardíaca Nkx2.5A linha transgénica potenciador rato 19 foram utilizados para analisar a expressão dos genes de pluripotência por citometria de fluxo. Experiências-piloto com 400 pM do controlo captação positiva rendeu claramente Cy3 positivas ES vivos colônias sob o microscópio e citometria de fluxo detectado quase 40% de células positivas Cy3 (Figura 7C). Em contraste, comparável com células não tratadas, aproximadamente, 0,1% de células tratadas com a precipitação corado positivo (dados não mostrados). Do mesmo modo a adição de nanopartículas específicas para o GAPDH, e Nanog Gdf3 induziu um sinal de fluorescência distinta em colónias individuais na placa de cultura celular. A frequência de células positivas para Cy3 GAPDH como determinado por citometria de fluxo foi comparável ao observado para ambos os genes de pluripotência (Figura 7C). Este resultado é expectável como Nanog e Gdf3 também são pensados ​​para ser expresso constitutivamente em células ES pluripotentes. Assim, estes dados claramente INDICate que as células que expressam um gene particular pode ser identificado por análises de citometria de fluxo, qualitativamente e pela sua quantidade relativa. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Figura 1: Representação esquemática da estrutura das nanopartículas. (A) a estrutura de uma nanopartícula específico do gene. (B) Precipitação de nanopartículas (controlo negativo). (C) A absorção de nanopartículas (controlo positivo). Adaptado de Lahm et al. 17, reproduzido com permissão de Wiley. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Figura 2: Aplicação de nanopartículas para culturas de células uma solução apropriadamente diluída de nanopartículas é pipetado simplesmente para o meio de cultura.. Depois de O / células específicos do gene de incubação N fluorescentes são visíveis sob af<html> luorescent microscópio. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Figura 3:. A absorção activa de nanopartículas pelas células através de endocitose (A) Células envolver activamente as nanopartículas por endocitose (B) alvo mRNA se liga ao fio de captura e desloca o repórter fluorescente.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Figura 4: Estratégia Gating para citometria de fluxo. (A) Estratégia para HEK 293 células. (B) Estratégia para células-tronco embrionárias de ratinho. Os dados foram adquiridos utilizando um dispositivo para células HEK 293 ou dispositivo 2 para células ES de murídeo e foram subsequentemente analisados ​​por uma ferramenta de software (ver Tabela de Materiais). /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Análise de GAPDH -expressão em células HEK 293 Uma nanopartícula especï¿½ico GAPDH foi adicionado às células a 100 pM (concentração final) e a fluorescência foi registada depois de O / N de incubação (A) GAPDH nanopartículas especï¿½ico (B.. ) Scramble (controle negativo). (C) Captação (controle positivo). (D) Cinética de precipitação e controle de absorção. A fluorescência foi determinada no momento de pontos indicados após a adição de nanopartículas GAPDH especï¿½icos. Barras de escala representam 50? M. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Figura 6:. Análise do Gene pluripotência expressão em células de diferentes espécies iPS Nanopartículas específico para NANOG ou GDF3 foram adicionados às células a 400 pM (conce definitivantration) e fluorescência foi gravado depois de O / N incubação. (A) células iPS Murino. (B) células iPS humanas. (C) células iPS Porcina. Setas em (A) e (C) designar células alimentador de camada de fibroblastos não marcado. (D) de fluorescência em células iPS murino após a adição do NANOG-design SF3 nanopartículas. Barras de escala representam 50? M. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Figura 7: Nanoparticle Rotulado células vivas podem ser identificados por citometria de fluxo. (A) vista microscópica de Cy3 HEK positivo 293 células após a adição de diferentes concentrações de nanopartículas. (B) A frequência de células positivas Cy3 determinadas por citometria de fluxo. (C) A coloração por vivo de murino colónias de células ES e determinação da frequência de Cy3 positiva células. As nanopartículas foram adicionadosa uma concentração final de 400 pM. Barras de escala representam 50? M.

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Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

detection-intracellular-gene-expression-live-cells-murine-human

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Vídeo: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...