Neste vídeo, descrevemos um estudo modelo para o mecanismo da toxicidade amiloide no nível da membrana usando mitocôndrias cerebrais de ratos como um modelo biológico in vitro. Apesar de acumular relatório descrevendo mecanismo de perturbações de membrana por agregado amiloide em sistemas modelo fosfolipídico estudados diretamente visando os eventos que começam no desenvolvimento da membrana biológica. No presente vídeo, descrevemos fibrilas amiloides de alfa-sinucleína analisando a membrana mitocôndria cerebral de rato como um modelo biológico in vitro.
Acreditamos que as mitocôndrias como uma organela com membranas bem caracterizadas podem fornecer um sistema de modelo biológico extremamente útil para estudos moleculares relacionados ao mecanismo de citotoxicidade amiloide no nível da membrana relacionada a doenças neurodegenerativas. Decapite o rato com uma guilhotina animal pequena e remova o cérebro da escala dentro de um minuto da decapitação do rato para limitar a possível deterioração das propriedades mitocondriais. É importante trabalhar rapidamente e manter tudo no gelo durante todo o procedimento.
Lave o tecido duas vezes com 30 mililitros de tampão de isolamento. Transfira para um béquer contendo tampão de isolamento frio e pique finamente o cérebro com uma tesoura. Transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador de dounce frio de 20 mililitros.
Homogeneize os pedaços de tecido usando nove traços para cima e para baixo com um pilão motorizado. Deixe a mistura no gelo por aproximadamente 30 segundos após cada conjunto de três golpes de homogeneização para garantir que a homogeneização permaneça fria. Transfira o homogene de homogene para um tubo de centrífuga pré-refrigerado e centrífuga a 1.300 G a quatro centígrados por três minutos.
Decante cuidadosamente o supernatante e transfira-o para um tubo de centrífuga pré-refrigerado. Centrífuga a 21.000 G em quatro centígrados por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um meio de gradiente de densidade, mexendo suavemente a mistura com a pipeta.
Centrífuga em um rotor de ângulo fixo a 30,700 G em quatro Centígrados por cinco minutos. Usando uma pipeta Pasteur, remova a extremidade afiada do material acumulado na parte superior, que contém principalmente mielina. Adicione oito amortecedores de isolamento mililitro à fração mitocondrial enquanto mexe suavemente a mistura com a pipeta.
Centrífuga a 16.700 G em quatro centígrados por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernatante, deixando a pelota solta sem ser perturbada. Adicione um mililitro de 10 miligramas por mililitro sem ácido graxo BSA ao tubo de centrífuga enquanto mexe suavemente a mistura com a ponta da pipeta.
Coma o volume a cinco mililitros adicionando tampão de isolamento. Centrífuga a 6.900 G em quatro centígrados por 10 minutos. Isso deve produzir uma pelota firme.
Decante o supernatante e reaproste bem a pelota mitocondrial no tampão de isolamento. Diluir a homogeneizar mitocondrial a um miligrama por mililitro com tampão de isolamento frio e colocar em dois tubos de 1,5 mililitro, tipicamente 195 microliteres de mitocôndrias por tubo. Adicione cinco microliter 20% de volume por volume Triton X-100 a um tubo como controle positivo para a atividade máxima da enzima e cinco microliter de água deionizada a outro tubo para controle, seguido pela mistura com um agitador.
Incubar os tubos por 10 minutos em banho de água morna definido para 30 centígrados. Mitocôndrias de pelotas por centrifugação de tubos em um rotor de ângulo fixo a 16.000 G quatro Centígradas por 15 minutos. Colete cuidadosamente os supernantes resultantes para avaliar a atividade do desidrogenase de malate mitocondrial usando um ensaio espectrofotométrico padrão descrito na próxima parte.
Calcule a integridade da membrana mitocondrial da seguinte forma. Para determinação de atividade de desidrogenase malate, pipeta 890 e 880 microliter 50 mililitros Tris-HCL tampão para pó e amostra de cuvettes de teste, respectivamente seguido por 100 microliter 50 milimolar oxaloacetato e 10 microliter de 10 milimolar beta-NADH. Coloque as cuvetas em um espectrofotômetro e referência contra o espaço em branco.
Adicione 10 microliter mitocondrial homogeneizar um miligrama por mililitro para provar cuvette. Misture imediatamente por inversão. Queda recorde na absorvância devido à oxidação de NADH em 340 nanômetros por um minuto.
Para fibrilação amiloide alfa-sinucleína, adicione 294 microliter de solução proteica, 200 micromolar a cada tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione seis soluçãos de ThT de microliter um mililitro. Misture as soluções e incuba os tubos em um termomixer a 37 Centígrados sob constante agitação a 800 RPM.
Para fibrilação amiloide de insulina bovina, adicione 637 microliteres de solução proteica, 250 micromolar a tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 13 microliter ThT solução um mililitro seguido de agitação. Adicione alíquotas de 200 microliter de soluções proteicas a cada poço de uma placa de fundo claro de 96 poços.
Sele a placa com fita de vedação cristalina. Coloque a placa no leitor de placas de fluorescência Cytation 5. Meça fluorescência tht em intervalos de 30 minutos durante 12 horas.
Use excitação a 440 nanômetros e emissão a 485 nanômetros. Selecione os poços. Agite a placa por cinco segundos antes de cada medição.
Coloque a temperatura em 57 centígrados sem agitação. Prepare duas séries de tubos de 1,5 mililitro contendo homogeneados mitocondriais, uma série para ensaio de liberação de MDH e outra para medição de ROS mitocondrial. Adicione alíquotas de fibrilas frescas ou amiloides de alfa-sinucleína, insulina bovina ou lysozyme branco de ovo de galinha ao homogeneato mitocondrial seguido de pipetação suave.
Incubar tubos contendo suspensões mitocondriais por 30 minutos em banho de água morna definidos para 30 centígrados. Para ensaio de liberação de desidrogenase malate, centrífuga incubada alfabetizados mitocondriais a 16.000 G por 15 minutos. Colete cuidadosamente os supernantes resultantes para avaliar a atividade do MDH mitocondrial, conforme descrito na seção de protocolo parte quatro.
Calcule a liberação do MDH da seguinte forma. Para medição mitocondrial ros, pipeta 191 microliter de homogeneizar mitocondrial incubado para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione quatro microliter de 50 micromolars DCFDA.
Em seguida, adicione cinco microliter de 200 mililitros de succinato. Incubar a placa por 30 minutos em banho de água morna definido para 30 centígrados enquanto mexe suavemente. Coloque a placa em um leitor de placa de fluorescência Cytation 5 e meça a intensidade da fluorescência de acordo com a seção de protocolo.
A integridade da membrana mitocondrial foi avaliada pela medição da atividade de MDH nas mitocôndrias isoladas antes e depois da interrupção da membrana e liberação de enzimas por Triton X-100. Como você vê, normalmente descobrimos que os preparativos mitocondriais estão cerca de 93% intactos. O ensaio de fluorescência tht foi realizado para monitorar o crescimento de fibrilas amiloides.
A curva para fibrilação amiloide de três proteínas mostrou um padrão sigmoidal típico, atingindo um platô em cerca de 96, 12 e 96 horas para alfa-sinucleína, insulina bovina e lisesozyme de ovo de galinha, respectivamente, sugerindo formação de fibrilas amiloides que foi mais confirmada pela medição da AFM. A possível permeabilização e dano da membrana mitocondrial por fibrilas amiloides foi investigada pela liberação da medição mitocondrial de MDH e ROS mitocondrial. Como você vê no gráfico esquerdo, a liberação substancial de MDH foi observada após a adição das fibrilas amiloides alfa-sinucleínas às mitocôndrias.
Enquanto uma leve liberação foi detectada por fibrilas de insulina, fibrilas de lise de lise de lysozyme brancas de galinha foram consideradas ineficazes. O gráfico certo mostra o efeito das fibrilas amiloides no conteúdo ROS mitocondrial. Embora nenhum aumento significativo na ROS mitocondrial tenha sido observado após a adição de lisesozyme branco de ovo de galinha ou fibrilas amiloides de insulina, o tratamento com fibrilas alfa-sinucleína levou a um aumento considerável no teor de ROS de mitocôndrias cerebrais.
O presente vídeo descreve um estudo modelo para o mecanismo da citotoxicidade agregada da fíbula ao nível da membrana, demonstrando como fibrils amiloides decorrentes de várias proteínas podem causar diferentes graus de dano à membrana e permeabilização. Enquanto alguns tópicos de fibrilas amiloides e sua membrana de ligação específica parecem fornecer a capacidade de interagir e causar desestabilização e perturbações subsequentes de membranas. Após este vídeo, você poderá investigar a interação de formas nativas, fibrilações amiloides pré-fibrilais e maduras de diferentes peptídeos e com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos ou várias áreas do cérebro.
