This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. celular Galvanização e Transfecção <ol><li> Num capuz de cultura de células, a placa de ~ 300.000 a ~ 500.000 SN56 células (uma gentil oferta do Dr. Jane Rylett) sobre uma 35 mm prato confocal com fundo de vidro e cobrem com meio de pré-transfecção (Dulbecco Modified Eagle Médium, DMEM, suplementado com 10% de FBS). </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 a proliferar. Nota: As células devem ser de aproximadamente 50% -70% confluentes antes da transfecção. </li><li> Num capuz de cultura de células, as células transfectar com os plasmídeos que expressam uma proteína fluorescente etiquetado marcador TGN (galactosiltransferase acoplados à proteína ciano fluorescente, GalT-PCP), uma proteína fluorescente etiquetado marcador compartimento (aqui, lisossoma proteína associada à membrana 1, LAMP1, marcado com MRFP), e a proteína de interesse marcado com paGFP (pAPP-paGFP). (Estas construções foram previamente descritas 30) </li><li> Incubar as células com o reagente de transfecção de ADN e o plasmídeo Fou 24 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Usar uma proporção de ~ 2 ug de ADN de 5 ul de agente de transfecção (por exemplo, Lipofectamine 2000) para melhor equilíbrio citotoxicidade e eficácia de transfecção. Concentrações reais podem precisar de ser otimizado para diferentes plasmídeos. Nas experiências aqui descritas, usar 1 ug / prato confocal de pAPP-paGFP, 0,3 ug / prato confocal de LAMP1-MRFP, e 0,2 ug / prato confocal de GalT-PCP. Nota: A quantidade de plasmídeo utilizado dependerá da eficiência de transfecção. </li><li> Para linhas de células neuronais: Após o passo 1.4, em um capuz de cultura de células, remove meios de pré-transfecção e diferenciar células SN56 em 2 ml de DMEM suplementado com 0,1% de penicilina / estreptomicina, com 1 mM de dibutiril-AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 h. </li></ol> 2. Microscópio fase de preparação <ol><li> Pré-quente solução salina tamponada com fosfato (PBS) e Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscópio antes imaging a 37 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS, para remover e substituir meios de diferenciação com 2 ml de HBSS a 37 ° C. Células colocar no palco microscópio aquecida a 37 ° C. Nota: As células são viáveis ​​para aproximadamente 1,5-2 hr em HBSS. </li><li> Permitir 5-10 minutos para a temperatura da placa confocal para equilibrar com a platina do microscópio. </li></ol> 3. Photo-ativação do ROI sobre o Golgi <ol><li> Com a ocular do microscópio, encontrar células transfectadas com GalT-PCP, LAMP1-MRFP, e PAPP-paGFP. <ol><li> Use uma lente de imersão em óleo com alta ampliação (ou seja, 63X ou 100X). Para conformação visual de fluorescência, use um conjunto de filtros capaz de visualizar FITC (para PCP e fluorescência da GFP) e rodamina (para MRFP fluorescência). </li></ol></li><li> Defina a fatia confocal para cada canal de 1 um. Pegue uma imagem de baixa resolução. </li><li> Cortar a imagem apenas a célula de interesse. </li><li> Usando o botão de ajuste, defina manualmenteo plano focal para o meio da célula. Esta é normalmente a parte da célula, onde o núcleo é a maior. </li><li> Empate 3-5 Regiões circulares de Interesses (ROI) dentro do TGN (GalT-PCP fluorescência). <ol><li> Para desenhar ROIs (ou seja, no programa Zeiss LSM), selecione o botão &quot;Editar ROI &#39;no console de comando. </li><li> Selecione o botão de ROI circular. </li><li> Clique e arraste sobre GalT-PCP regiões positivos da célula. Nota: Os pacotes de foto-branqueamento de muitos microscópios têm esta capacidade. </li></ol></li><li> Pegue uma imagem do celular com o ROIs sobreposta. Salvar uma cópia dos ROIs para consulta posterior. <ol><li> Para salvar o ROI com a imagem, selecione o botão &quot;Macro&quot;. </li><li> Pressione o botão &#39;Load&#39; para iniciar o &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (caminho do arquivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Nota: Um microscópio confocal equipado com 475-525 nm (PCP) passa banda (BP), um 500-530 nm BP (GFP),e um 560 nm passe (LP) conjuntos de filtros são obrigatórios. Também é necessário um laser de árgon de 458 nm e 488 nm de emissão de laser de HeNe e uma emissão de 540 nm. </li></ol></li><li> Set-up do microscópio por um curso de tempo lixívia. <ol><li> Defina o diodo laser (laser de 25 mW 405 nm) para potência máxima. Cuidado: foto-ativação excessiva poderia conduzir a foto-toxicidade ou dano às membranas celulares. Use proteção para os olhos, para evitar danos na retina. </li><li> Set-up do microscópio por 120 ciclos de imagem. Nota: Um ciclo de imagem consiste de branqueamento dentro do ROI e imagem de toda a célula. Este é um curso de tempo de branqueamento. </li><li> Defina o microscópio para branquear (foto-ativar) apenas o ROI por 20-30 iterações após cada imagem. O tempo para a imagem e lixívia uma imagem variará. Defina um atraso de tempo entre imagens para cada ciclo é de aproximadamente 30 segundos. Nota: A parte de imagem de cada ciclo demora cerca de 15-30 segundos, dependendo do tamanho da imagem. O branqueamento para cada ROEu é de cerca de 50 mseg. Branqueamento de todos os 4 ROIs para 20 iterações terá 4 segundos no final de cada ciclo de lixívia / imagem. </li></ol></li><li> Inicie o curso de tempo de branqueamento. </li><li> Desligue o branqueamento depois de 15 min (30 ciclos de imagiologia e de branqueamento), mas continuar a capturar imagens da célula. Nota: Tempo de 0 a 15 min é o período de &#39;pulso&#39;. </li><li> Continuar a capturar imagens durante 45 minutos (sem clareamento), a seguir o apuramento de PAPP-paGFP. Nota: Tempo 15 a 45 minutos é o período de &#39;perseguição&#39;. </li><li> Utilizando o método descrito no passo 6, a co-localizar a proteína de interesse (aqui, pAPP-paGFP) com o compartimento de interesse (aqui, LAMP1-MRFP), tornando as superfícies de cada canal. </li></ol> 4. Determine o compartimento Downstream <ol><li> Para determinar se os lisossomas (nestas experiências) são o compartimento final, adicionar inibidores da protease a membranas permeáveis ​​para causar proteínas que se acumulam no lisossoma.<ol><li> Para pAPP, usar 0,5 uM L685, 458 (inibidor específico γ-secretase) durante a noite ou 100 uM de cloroquina (deacidifies lisossomas) durante 30 min antes de imagem. </li></ol></li><li> Encontre células e fotoactivar como no passo 3,1-3,8. </li><li> Imagem do celular para um 45 min (sem foto-ativação) para determinar onde PAPP-paGFP se acumula na ausência de clivagem. </li><li> Analisar a entrega de proteína para os lisossomas (ou outro compartimento a jusante) e subsequente depuração de acordo com o método descrito no passo 6. </li></ol> 5. garantir a precisão de Photo-ativação dentro do Golgi <ol><li> Warm-up HBSS a 37 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de 2 ml, para cada placa confocal a ser trabalhada, de 66 uM de nocodazole (tratamento) ou DMSO (controlo) em HBSS. <ol><li> Para uma placa confocal, pipeta de 2 ml de 37 ° C e adicionar 7,96 HBSS ul de nocodazol a partir de um estoque de nocodazole 16.60 mM. </li><li> Como um controlo tãolução, pipeta de 2 ml de 37 ° C HBSS para um tubo de 2 mL e adicionar 7,96 mL de DMSO. </li></ol></li><li> Incubar as células em HBSS com nocodazol ou DMSO durante 5 min antes de imagem. </li><li> Encontrar células como no passo 3.1. </li><li> Antes de fotoativação, preparar o microscópio para tomar uma pilha de Z após o período de foto-ativação. <ol><li> Clique no botão &#39;Z Stack&#39;. Inicie a digitalização usando XY rápido. </li><li> Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte superior da célula. Prima &#39;Mark Primeira&#39; para definir a primeira posição na pilha. </li><li> Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte inferior (mais próxima do vidro) da célula. Pressione &quot;Mark Última &#39;para definir a última posição na pilha. </li><li> No painel pilha a Z, pressione o botão &#39;Z seccionamento&#39;. Defina o &#39;Intervalo&#39; para 1 mícron. Nota: Para uma maior resolução espacial empilhar um intervalo de pilha menor, mas mais fotos precisaráser feita alongar o período de formação de imagens para a pilha. </li></ol></li><li> Descorar as células, tal como descrito no passo 3,7-3,8. Photo-activate e imagem de 0 min a 15 min (30 quadros). </li><li> Pare de imagem depois de 30 frames. Salve imediatamente uma imagem do vídeo. Atenção: Alguns microscópios pode substituir primeiro vídeo se ele não é salvo antes de iniciar uma segunda sequência de imagem. </li><li> Depois de gravar o vídeo, adquire imediatamente uma pilha de Z, utilizando os parâmetros do passo 5.5. </li><li> Co-localizam-pAPP paGFP com GalT-PCP (ou outro marcador de Golgi), tal como descrito no passo 6. Nota: PCP fotobranqueadores rapidamente e pode não ser visível no final do período de imagem. Co-localização pode não ser possível com GalT-PCP. Se co-localização é necessária, use a tag GalT MRFP. </li></ol> 6. Vesicle Filtragem e co-localização <ol><li> Utilizar um programa de análise (por exemplo Imaris) para tornar as superfícies do compartimento (por exemplo LAMP1-MRFP) e uma proteína óf interesse (por exemplo, PAPP-paGFP). </li><li> Entre na seção &quot;Superar &#39;do programa de análise clicando no botão Ultrapasse na barra de menu superior. </li><li> Selecione o botão do assistente de superfície na parte superior do painel à esquerda a maioria (5 th botão a partir da esquerda). </li><li> Selecione um canal para filtrar vesículas (ou seja, PAPP-paGFP fluorescência, proteína de interesse). </li><li> Realizar a subtração de fundo, apresentando o diâmetro do maior vesícula no campo para o assistente e pressione próximo. O programa de análise selecciona automaticamente - com base num limiar deriva da maior vesícula no campo - uma área no canal de interesse. <ol><li> Ajustar manualmente o fundo limiar para refinar a seleção, se necessário. </li></ol></li><li> Na parte inferior da tela de seleção de Threshold, verificar a opção &#39;objetos&#39; tocar Dividir para separar as superfícies combinadas. Nota: Se muitas vesículas estão estreitamente agrupadas paraGether, a vontade grupo programa de análise desses objetos em uma superfície. <ol><li> Escolha 10-15 vesículas representativos e calcular o diâmetro médio de vesícula e digite o resultado para o assistente. </li></ol></li><li> Limitar os pontos de sementes seleccionadas, aumentando ou diminuindo o limiar de &quot;Qualidade&quot; (intensidade do canal no meio de cada ponto). Nota: As superfícies do canal de juros será criado. Outro refinamento das superfícies seleccionados pode ser realizada neste ponto. Vesículas limite baseado no número de pixels de cada vesícula. </li><li> Mascarar o canal original com esta superfície. Para mascarar, selecione a guia 4 a partir da esquerda no assistente de criação de superfície (lápis). </li><li> Selecione &#39;Máscara All&#39;. Um novo canal com as vesículas de interesse será criado. Nota: Durante o processo de máscara, uma opção para duplicar o canal original é oferecido. Selecione essa opção se os dados originais precisa ser salvo. </li><li> Repita sPTE 6.1 através de 6.7 para o canal não filtrada (ou seja LAMP1 MRFP, compartimento). </li><li> Na barra de ferramentas superior, selecione a ferramenta co-localização. <ol><li> No painel superior, como os histogramas dos canais a serem colocalized aparecer, selecione os canais mascarados recentemente criadas. </li><li> Selecione todos os dados disponíveis. Existem pixels escuros que às vezes estão presentes após a análise. Não selecionar esses pixels no histograma, eles vão distorcer os resultados. </li><li> No painel da direita, selecione &quot;Criar Coloc Canal &#39;. Isso cria um novo canal contendo apenas os pixels colocalized. Os dados estarão no mesmo painel sob o botão &quot;Canal Estatísticas &#39;. Os dados podem ser exportados como um arquivo .csv. </li><li> Use o &quot;Percentual de material colocalized &#39;estatística. Esta opção tem em conta a intensidade dos pixels e tamanho do objecto. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros ou conflitos de interesse.

Esta técnica descreve a foto-ativação precisa de proteínas de membrana marcados com paGFP no TGN para visualizar tráfico e subsequente clivagem. Enquanto paGFP foi criada mais de uma década de 25, este é o primeiro exemplo de foto-ativação precisa de seguir o tráfico de proteínas nascentes para compartimentos jusante. Estudos anteriores utilizando APP-paGFP constrói uma região peri-nuclear da célula, a qual foi considerada o Golgi-11 activado foto. No entanto, como é evidente nas nos...

A característica da doença de Alzheimer (DA) é a presença de placas senis e emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro. O constituinte principal das placas senis é β-amilóide (Ap). Ap é derivado de seu precursor; proteína precursora de amilóide (APP) 1. A clivagem de APP amiloidogï¿½ica começa com a remoção do ectodomínio de APP pela secretase β-2. O fragmento do terminal carboxilo de 99-resíduo remanescente (CTF) pode ser clivado pela secretase γ para produzir Ap 3-7. Enquanto muitas experiências documentaram a clivagem de APP na superfície celular após a internalização a partir da superfície da célula para o sistema endossomal / lisossomal, uma série de estudos recentes têm sugerido que o tráfico intracelular da APP também é importante na regulação da sua transformação 8-11. Tem havido uma série de tentativas de modular os níveis de Ap com inibidores y-secretase e Ap Immunotherapies. No entanto, os ensaios clínicos recentes com essas terapias não mostrou nenhum benefício, e, em alguns casos, causaram danos 12. Uma estratégia inexplorada de modular a produção de Ap é alterar a localização sub-celular de APP e interacção γ-secretase. Os Golgi, membrana de plasma, e endosomes / lisossomos têm sido sugeridos como possíveis locais para γ-clivagem de APP. Pesquisas no nosso laboratório sugerem que a APP eo γ-secretase são proteínas residentes da membrana lisossomal 13. Além disso, verificou-se que o lisossomais γ-secretase tem um pH óptimo ácido 13. Além disso, a alcalinização do sistema endossomal / lisossomal com cloroquina ou NH4Cl, foi demonstrado para diminuir a produção de Ap 14. y-secretase inibição ou nocaute ou Presenilin leva ao acúmulo APP-CTFs no lisossoma 15-17. Além disso, interrompendo APP endocitose reduz a produção de Ap 18-20. Apesar da importância do Golgi como uma estação de triagem para as proteínas e as proteínas reciclados a partir do sistema endossomal / lisossomal nascentes, o tráfico intracelular de APP não tem sido estudada em pormenor 21. Um trabalho recente demonstrou que a APP pode ser reciclado para a rede trans-Golgi (TGN), através de interacção com o complexo retromer. Regulação para baixo do complexo retromer diminui a produção de Ap 8,22-24. No entanto, a saída de APP a partir do Golgi, não tem sido bem estudada. Ao seguir a endocitose de proteínas de superfície celular, tais como o receptor de transferrina, são facilmente identificados e seguidos, após o tráfico de proteínas intracelulares é mais difícil. Na verdade, poucas proteínas tiveram seu tráfego intracelular trabalhada. O advento das marcas de proteínas fluorescentes, tais como foto-activável-GFP (paGFP), tem proporcionado novas ferramentas para examinar o tráfico intracelular. Photo-activatable-GFP é uma forma de GFP que é quase invisível após a síntese, mas desenvolve verde forte (GFP) de fluorescência depois de ser ativado por 413 nm de luz laser e este sinal é estável durante dias 25,26. Constructos usando paGFP têm sido utilizados para demonstrar o tráfico intralisossomal da proteína lisossómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, a entrega da superfície da célula do vírus da estomatite vesicular glicoproteína (VSVG, um marcador da via secretora) 27, e o volume de peroxissomas 28 e 29 autofagossomas. A fim de visualizar a triagem de APP do TGN em células vivas, que concebido plasmídeo expressando os últimos 112 aminoácidos da APP acoplados a foto-activável (paGFP) no terminal C (referida como pAPP-paGFP) 30. Também realizamos esses experimentos com APP de comprimento total e alcançou resultados semelhantes; a construção pAPP é usado aqui porque fornece imagens mais brilhantes. Em seguida, foto-activate &amp;# 946; APP-paGFP apenas no TGN, como demarcada pela TGN marcador Galactosiltransferase (GalT). Embora APP foi marcado com paGFP para visualizar o transporte axonal rápido da APP e autorização da região perinuclear, esta é a primeira demonstração de tráfico de APP de um compartimento cuidadosamente definidos para outro 11,31,32. Aqui, nós demonstramos foto-ativação exata dentro do TGN ea saída de APP em compartimentos jusante e subsequente clivagem e apuramento de lisossomos 30. A foto-activação preciso dentro do Golgi é amplamente aplicável a outros sistemas de proteínas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-amilóide (Ap) é o constituinte principal das placas senis encontradas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Ap é derivado da clivagem sequencial da Proteína Precursora Amilóide (APP) por β e y-secretases. Apesar da importância de Ap a patologia da DA, a localização subcelular destas clivagens não está bem estabelecida. Trabalhar em nosso laboratório e outros implicam o sistema endossomal / lisossomal no processamento de APP após a internalização da superfície da célula. No entanto, o tráfego intracelular da APP é relativamente pouco estudada. Embora as proteínas da superfície celular são alteráveis ​​a muitas técnicas de marcação, não existem métodos simples para seguir o tráfico de proteínas de membrana a partir do Golgi. Para este fim, criada construções de APP que foram marcados com foto-activável GFP (paGFP) na extremidade C-terminal. Após a síntese, paGFP tem baixa fluorescência basal, mas pode ser estimulado com luz de 413 nm, to produzir uma fluorescência verde forte, estável. Ao utilizar o marcador de Golgi galactosiltransferase acoplados à proteína fluorescente ciano (GalT-PCP) como um alvo, que são capazes de APP com precisão fotoactivar na rede trans-Golgi. Photo-ativado APP-paGFP pode então ser seguido, uma vez que trafica para compartimentos jusante identificados com fluorescente etiquetado proteínas marcadoras compartimento para o endossomo precoce (Rab5), o falecido endosome (Rab9) e do lisossoma (LAMP1). Além disso, o uso de inibidores do processamento de APP, incluindo o inibidor de cloroquina ou L685 γ-secretase, 458, que são capazes de realizar experiências pulse-chase para examinar o processamento de APP em células individuais. Descobrimos que uma grande fracção da APP move-se rapidamente para o lisossoma sem aparecer na superfície da célula, e é então eliminado do lisossoma por clivagens-secretase semelhantes. Esta técnica demonstra a utilidade de paGFP para seguir o tráfico e processamento de proteínas intracelulares from o Golgi para compartimentos a jusante.

Os resultados típicos mostram pAPP deixar o TGN e parece tráfego rapidamente para LAMP1 (Figura 1a e b). Durante o período de foto-activação, as vesículas podem ser vistos com partida no Golgi destinado para os lisossomas (Figura 1b). Sem tratamento inibidor, paGFP fluorescência será visível nos lisossomos enquanto houver foto-ativação no TGN. Depois de parar fotoativação, a PAPP-paGFP é rapidamente eliminado do lisossoma (comparar Figura 1a a 1b)....

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP at JoVE.com

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  Western University.  Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração. 