This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. celular Galvanização e Transfecção <ol><li> Num capuz de cultura de células, a placa de ~ 300.000 a ~ 500.000 SN56 células (uma gentil oferta do Dr. Jane Rylett) sobre uma 35 mm prato confocal com fundo de vidro e cobrem com meio de pré-transfecção (Dulbecco Modified Eagle Médium, DMEM, suplementado com 10% de FBS). </li><li> Incubar as células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 a proliferar. Nota: As células devem ser de aproximadamente 50% -70% confluentes antes da transfecção. </li><li> Num capuz de cultura de células, as células transfectar com os plasmídeos que expressam uma proteína fluorescente etiquetado marcador TGN (galactosiltransferase acoplados à proteína ciano fluorescente, GalT-PCP), uma proteína fluorescente etiquetado marcador compartimento (aqui, lisossoma proteína associada à membrana 1, LAMP1, marcado com MRFP), e a proteína de interesse marcado com paGFP (pAPP-paGFP). (Estas construções foram previamente descritas 30) </li><li> Incubar as células com o reagente de transfecção de ADN e o plasmídeo Fou 24 h a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Usar uma proporção de ~ 2 ug de ADN de 5 ul de agente de transfecção (por exemplo, Lipofectamine 2000) para melhor equilíbrio citotoxicidade e eficácia de transfecção. Concentrações reais podem precisar de ser otimizado para diferentes plasmídeos. Nas experiências aqui descritas, usar 1 ug / prato confocal de pAPP-paGFP, 0,3 ug / prato confocal de LAMP1-MRFP, e 0,2 ug / prato confocal de GalT-PCP. Nota: A quantidade de plasmídeo utilizado dependerá da eficiência de transfecção. </li><li> Para linhas de células neuronais: Após o passo 1.4, em um capuz de cultura de células, remove meios de pré-transfecção e diferenciar células SN56 em 2 ml de DMEM suplementado com 0,1% de penicilina / estreptomicina, com 1 mM de dibutiril-AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 h. </li></ol> 2. Microscópio fase de preparação <ol><li> Pré-quente solução salina tamponada com fosfato (PBS) e Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscópio antes imaging a 37 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS, para remover e substituir meios de diferenciação com 2 ml de HBSS a 37 ° C. Células colocar no palco microscópio aquecida a 37 ° C. Nota: As células são viáveis ​​para aproximadamente 1,5-2 hr em HBSS. </li><li> Permitir 5-10 minutos para a temperatura da placa confocal para equilibrar com a platina do microscópio. </li></ol> 3. Photo-ativação do ROI sobre o Golgi <ol><li> Com a ocular do microscópio, encontrar células transfectadas com GalT-PCP, LAMP1-MRFP, e PAPP-paGFP. <ol><li> Use uma lente de imersão em óleo com alta ampliação (ou seja, 63X ou 100X). Para conformação visual de fluorescência, use um conjunto de filtros capaz de visualizar FITC (para PCP e fluorescência da GFP) e rodamina (para MRFP fluorescência). </li></ol></li><li> Defina a fatia confocal para cada canal de 1 um. Pegue uma imagem de baixa resolução. </li><li> Cortar a imagem apenas a célula de interesse. </li><li> Usando o botão de ajuste, defina manualmenteo plano focal para o meio da célula. Esta é normalmente a parte da célula, onde o núcleo é a maior. </li><li> Empate 3-5 Regiões circulares de Interesses (ROI) dentro do TGN (GalT-PCP fluorescência). <ol><li> Para desenhar ROIs (ou seja, no programa Zeiss LSM), selecione o botão &quot;Editar ROI &#39;no console de comando. </li><li> Selecione o botão de ROI circular. </li><li> Clique e arraste sobre GalT-PCP regiões positivos da célula. Nota: Os pacotes de foto-branqueamento de muitos microscópios têm esta capacidade. </li></ol></li><li> Pegue uma imagem do celular com o ROIs sobreposta. Salvar uma cópia dos ROIs para consulta posterior. <ol><li> Para salvar o ROI com a imagem, selecione o botão &quot;Macro&quot;. </li><li> Pressione o botão &#39;Load&#39; para iniciar o &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (caminho do arquivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Nota: Um microscópio confocal equipado com 475-525 nm (PCP) passa banda (BP), um 500-530 nm BP (GFP),e um 560 nm passe (LP) conjuntos de filtros são obrigatórios. Também é necessário um laser de árgon de 458 nm e 488 nm de emissão de laser de HeNe e uma emissão de 540 nm. </li></ol></li><li> Set-up do microscópio por um curso de tempo lixívia. <ol><li> Defina o diodo laser (laser de 25 mW 405 nm) para potência máxima. Cuidado: foto-ativação excessiva poderia conduzir a foto-toxicidade ou dano às membranas celulares. Use proteção para os olhos, para evitar danos na retina. </li><li> Set-up do microscópio por 120 ciclos de imagem. Nota: Um ciclo de imagem consiste de branqueamento dentro do ROI e imagem de toda a célula. Este é um curso de tempo de branqueamento. </li><li> Defina o microscópio para branquear (foto-ativar) apenas o ROI por 20-30 iterações após cada imagem. O tempo para a imagem e lixívia uma imagem variará. Defina um atraso de tempo entre imagens para cada ciclo é de aproximadamente 30 segundos. Nota: A parte de imagem de cada ciclo demora cerca de 15-30 segundos, dependendo do tamanho da imagem. O branqueamento para cada ROEu é de cerca de 50 mseg. Branqueamento de todos os 4 ROIs para 20 iterações terá 4 segundos no final de cada ciclo de lixívia / imagem. </li></ol></li><li> Inicie o curso de tempo de branqueamento. </li><li> Desligue o branqueamento depois de 15 min (30 ciclos de imagiologia e de branqueamento), mas continuar a capturar imagens da célula. Nota: Tempo de 0 a 15 min é o período de &#39;pulso&#39;. </li><li> Continuar a capturar imagens durante 45 minutos (sem clareamento), a seguir o apuramento de PAPP-paGFP. Nota: Tempo 15 a 45 minutos é o período de &#39;perseguição&#39;. </li><li> Utilizando o método descrito no passo 6, a co-localizar a proteína de interesse (aqui, pAPP-paGFP) com o compartimento de interesse (aqui, LAMP1-MRFP), tornando as superfícies de cada canal. </li></ol> 4. Determine o compartimento Downstream <ol><li> Para determinar se os lisossomas (nestas experiências) são o compartimento final, adicionar inibidores da protease a membranas permeáveis ​​para causar proteínas que se acumulam no lisossoma.<ol><li> Para pAPP, usar 0,5 uM L685, 458 (inibidor específico γ-secretase) durante a noite ou 100 uM de cloroquina (deacidifies lisossomas) durante 30 min antes de imagem. </li></ol></li><li> Encontre células e fotoactivar como no passo 3,1-3,8. </li><li> Imagem do celular para um 45 min (sem foto-ativação) para determinar onde PAPP-paGFP se acumula na ausência de clivagem. </li><li> Analisar a entrega de proteína para os lisossomas (ou outro compartimento a jusante) e subsequente depuração de acordo com o método descrito no passo 6. </li></ol> 5. garantir a precisão de Photo-ativação dentro do Golgi <ol><li> Warm-up HBSS a 37 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de 2 ml, para cada placa confocal a ser trabalhada, de 66 uM de nocodazole (tratamento) ou DMSO (controlo) em HBSS. <ol><li> Para uma placa confocal, pipeta de 2 ml de 37 ° C e adicionar 7,96 HBSS ul de nocodazol a partir de um estoque de nocodazole 16.60 mM. </li><li> Como um controlo tãolução, pipeta de 2 ml de 37 ° C HBSS para um tubo de 2 mL e adicionar 7,96 mL de DMSO. </li></ol></li><li> Incubar as células em HBSS com nocodazol ou DMSO durante 5 min antes de imagem. </li><li> Encontrar células como no passo 3.1. </li><li> Antes de fotoativação, preparar o microscópio para tomar uma pilha de Z após o período de foto-ativação. <ol><li> Clique no botão &#39;Z Stack&#39;. Inicie a digitalização usando XY rápido. </li><li> Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte superior da célula. Prima &#39;Mark Primeira&#39; para definir a primeira posição na pilha. </li><li> Ajustar o plano focal com o botão de ajuste do microscópio para a parte inferior (mais próxima do vidro) da célula. Pressione &quot;Mark Última &#39;para definir a última posição na pilha. </li><li> No painel pilha a Z, pressione o botão &#39;Z seccionamento&#39;. Defina o &#39;Intervalo&#39; para 1 mícron. Nota: Para uma maior resolução espacial empilhar um intervalo de pilha menor, mas mais fotos precisaráser feita alongar o período de formação de imagens para a pilha. </li></ol></li><li> Descorar as células, tal como descrito no passo 3,7-3,8. Photo-activate e imagem de 0 min a 15 min (30 quadros). </li><li> Pare de imagem depois de 30 frames. Salve imediatamente uma imagem do vídeo. Atenção: Alguns microscópios pode substituir primeiro vídeo se ele não é salvo antes de iniciar uma segunda sequência de imagem. </li><li> Depois de gravar o vídeo, adquire imediatamente uma pilha de Z, utilizando os parâmetros do passo 5.5. </li><li> Co-localizam-pAPP paGFP com GalT-PCP (ou outro marcador de Golgi), tal como descrito no passo 6. Nota: PCP fotobranqueadores rapidamente e pode não ser visível no final do período de imagem. Co-localização pode não ser possível com GalT-PCP. Se co-localização é necessária, use a tag GalT MRFP. </li></ol> 6. Vesicle Filtragem e co-localização <ol><li> Utilizar um programa de análise (por exemplo Imaris) para tornar as superfícies do compartimento (por exemplo LAMP1-MRFP) e uma proteína óf interesse (por exemplo, PAPP-paGFP). </li><li> Entre na seção &quot;Superar &#39;do programa de análise clicando no botão Ultrapasse na barra de menu superior. </li><li> Selecione o botão do assistente de superfície na parte superior do painel à esquerda a maioria (5 th botão a partir da esquerda). </li><li> Selecione um canal para filtrar vesículas (ou seja, PAPP-paGFP fluorescência, proteína de interesse). </li><li> Realizar a subtração de fundo, apresentando o diâmetro do maior vesícula no campo para o assistente e pressione próximo. O programa de análise selecciona automaticamente - com base num limiar deriva da maior vesícula no campo - uma área no canal de interesse. <ol><li> Ajustar manualmente o fundo limiar para refinar a seleção, se necessário. </li></ol></li><li> Na parte inferior da tela de seleção de Threshold, verificar a opção &#39;objetos&#39; tocar Dividir para separar as superfícies combinadas. Nota: Se muitas vesículas estão estreitamente agrupadas paraGether, a vontade grupo programa de análise desses objetos em uma superfície. <ol><li> Escolha 10-15 vesículas representativos e calcular o diâmetro médio de vesícula e digite o resultado para o assistente. </li></ol></li><li> Limitar os pontos de sementes seleccionadas, aumentando ou diminuindo o limiar de &quot;Qualidade&quot; (intensidade do canal no meio de cada ponto). Nota: As superfícies do canal de juros será criado. Outro refinamento das superfícies seleccionados pode ser realizada neste ponto. Vesículas limite baseado no número de pixels de cada vesícula. </li><li> Mascarar o canal original com esta superfície. Para mascarar, selecione a guia 4 a partir da esquerda no assistente de criação de superfície (lápis). </li><li> Selecione &#39;Máscara All&#39;. Um novo canal com as vesículas de interesse será criado. Nota: Durante o processo de máscara, uma opção para duplicar o canal original é oferecido. Selecione essa opção se os dados originais precisa ser salvo. </li><li> Repita sPTE 6.1 através de 6.7 para o canal não filtrada (ou seja LAMP1 MRFP, compartimento). </li><li> Na barra de ferramentas superior, selecione a ferramenta co-localização. <ol><li> No painel superior, como os histogramas dos canais a serem colocalized aparecer, selecione os canais mascarados recentemente criadas. </li><li> Selecione todos os dados disponíveis. Existem pixels escuros que às vezes estão presentes após a análise. Não selecionar esses pixels no histograma, eles vão distorcer os resultados. </li><li> No painel da direita, selecione &quot;Criar Coloc Canal &#39;. Isso cria um novo canal contendo apenas os pixels colocalized. Os dados estarão no mesmo painel sob o botão &quot;Canal Estatísticas &#39;. Os dados podem ser exportados como um arquivo .csv. </li><li> Use o &quot;Percentual de material colocalized &#39;estatística. Esta opção tem em conta a intensidade dos pixels e tamanho do objecto. </li></ol></li></ol>

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A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Os autores não têm concorrentes interesses financeiros ou conflitos de interesse.

Esta técnica descreve a foto-ativação precisa de proteínas de membrana marcados com paGFP no TGN para visualizar tráfico e subsequente clivagem. Enquanto paGFP foi criada mais de uma década de 25, este é o primeiro exemplo de foto-ativação precisa de seguir o tráfico de proteínas nascentes para compartimentos jusante. Estudos anteriores utilizando APP-paGFP constrói uma região peri-nuclear da célula, a qual foi considerada o Golgi-11 activado foto. No entanto, como é evidente nas nos...

A característica da doença de Alzheimer (DA) é a presença de placas senis e emaranhados neurofibrilares (NFTs) no cérebro. O constituinte principal das placas senis é β-amilóide (Ap). Ap é derivado de seu precursor; proteína precursora de amilóide (APP) 1. A clivagem de APP amiloidogï¿½ica começa com a remoção do ectodomínio de APP pela secretase β-2. O fragmento do terminal carboxilo de 99-resíduo remanescente (CTF) pode ser clivado pela secretase γ para produzir Ap 3-7. Enquanto muitas experiências documentaram a clivagem de APP na superfície celular após a internalização a partir da superfície da célula para o sistema endossomal / lisossomal, uma série de estudos recentes têm sugerido que o tráfico intracelular da APP também é importante na regulação da sua transformação 8-11. Tem havido uma série de tentativas de modular os níveis de Ap com inibidores y-secretase e Ap Immunotherapies. No entanto, os ensaios clínicos recentes com essas terapias não mostrou nenhum benefício, e, em alguns casos, causaram danos 12. Uma estratégia inexplorada de modular a produção de Ap é alterar a localização sub-celular de APP e interacção γ-secretase. Os Golgi, membrana de plasma, e endosomes / lisossomos têm sido sugeridos como possíveis locais para γ-clivagem de APP. Pesquisas no nosso laboratório sugerem que a APP eo γ-secretase são proteínas residentes da membrana lisossomal 13. Além disso, verificou-se que o lisossomais γ-secretase tem um pH óptimo ácido 13. Além disso, a alcalinização do sistema endossomal / lisossomal com cloroquina ou NH4Cl, foi demonstrado para diminuir a produção de Ap 14. y-secretase inibição ou nocaute ou Presenilin leva ao acúmulo APP-CTFs no lisossoma 15-17. Além disso, interrompendo APP endocitose reduz a produção de Ap 18-20. Apesar da importância do Golgi como uma estação de triagem para as proteínas e as proteínas reciclados a partir do sistema endossomal / lisossomal nascentes, o tráfico intracelular de APP não tem sido estudada em pormenor 21. Um trabalho recente demonstrou que a APP pode ser reciclado para a rede trans-Golgi (TGN), através de interacção com o complexo retromer. Regulação para baixo do complexo retromer diminui a produção de Ap 8,22-24. No entanto, a saída de APP a partir do Golgi, não tem sido bem estudada. Ao seguir a endocitose de proteínas de superfície celular, tais como o receptor de transferrina, são facilmente identificados e seguidos, após o tráfico de proteínas intracelulares é mais difícil. Na verdade, poucas proteínas tiveram seu tráfego intracelular trabalhada. O advento das marcas de proteínas fluorescentes, tais como foto-activável-GFP (paGFP), tem proporcionado novas ferramentas para examinar o tráfico intracelular. Photo-activatable-GFP é uma forma de GFP que é quase invisível após a síntese, mas desenvolve verde forte (GFP) de fluorescência depois de ser ativado por 413 nm de luz laser e este sinal é estável durante dias 25,26. Constructos usando paGFP têm sido utilizados para demonstrar o tráfico intralisossomal da proteína lisossómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, a entrega da superfície da célula do vírus da estomatite vesicular glicoproteína (VSVG, um marcador da via secretora) 27, e o volume de peroxissomas 28 e 29 autofagossomas. A fim de visualizar a triagem de APP do TGN em células vivas, que concebido plasmídeo expressando os últimos 112 aminoácidos da APP acoplados a foto-activável (paGFP) no terminal C (referida como pAPP-paGFP) 30. Também realizamos esses experimentos com APP de comprimento total e alcançou resultados semelhantes; a construção pAPP é usado aqui porque fornece imagens mais brilhantes. Em seguida, foto-activate &amp;# 946; APP-paGFP apenas no TGN, como demarcada pela TGN marcador Galactosiltransferase (GalT). Embora APP foi marcado com paGFP para visualizar o transporte axonal rápido da APP e autorização da região perinuclear, esta é a primeira demonstração de tráfico de APP de um compartimento cuidadosamente definidos para outro 11,31,32. Aqui, nós demonstramos foto-ativação exata dentro do TGN ea saída de APP em compartimentos jusante e subsequente clivagem e apuramento de lisossomos 30. A foto-activação preciso dentro do Golgi é amplamente aplicável a outros sistemas de proteínas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-amilóide (Ap) é o constituinte principal das placas senis encontradas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer. Ap é derivado da clivagem sequencial da Proteína Precursora Amilóide (APP) por β e y-secretases. Apesar da importância de Ap a patologia da DA, a localização subcelular destas clivagens não está bem estabelecida. Trabalhar em nosso laboratório e outros implicam o sistema endossomal / lisossomal no processamento de APP após a internalização da superfície da célula. No entanto, o tráfego intracelular da APP é relativamente pouco estudada. Embora as proteínas da superfície celular são alteráveis ​​a muitas técnicas de marcação, não existem métodos simples para seguir o tráfico de proteínas de membrana a partir do Golgi. Para este fim, criada construções de APP que foram marcados com foto-activável GFP (paGFP) na extremidade C-terminal. Após a síntese, paGFP tem baixa fluorescência basal, mas pode ser estimulado com luz de 413 nm, to produzir uma fluorescência verde forte, estável. Ao utilizar o marcador de Golgi galactosiltransferase acoplados à proteína fluorescente ciano (GalT-PCP) como um alvo, que são capazes de APP com precisão fotoactivar na rede trans-Golgi. Photo-ativado APP-paGFP pode então ser seguido, uma vez que trafica para compartimentos jusante identificados com fluorescente etiquetado proteínas marcadoras compartimento para o endossomo precoce (Rab5), o falecido endosome (Rab9) e do lisossoma (LAMP1). Além disso, o uso de inibidores do processamento de APP, incluindo o inibidor de cloroquina ou L685 γ-secretase, 458, que são capazes de realizar experiências pulse-chase para examinar o processamento de APP em células individuais. Descobrimos que uma grande fracção da APP move-se rapidamente para o lisossoma sem aparecer na superfície da célula, e é então eliminado do lisossoma por clivagens-secretase semelhantes. Esta técnica demonstra a utilidade de paGFP para seguir o tráfico e processamento de proteínas intracelulares from o Golgi para compartimentos a jusante.

Os resultados típicos mostram pAPP deixar o TGN e parece tráfego rapidamente para LAMP1 (Figura 1a e b). Durante o período de foto-activação, as vesículas podem ser vistos com partida no Golgi destinado para os lisossomas (Figura 1b). Sem tratamento inibidor, paGFP fluorescência será visível nos lisossomos enquanto houver foto-ativação no TGN. Depois de parar fotoativação, a PAPP-paGFP é rapidamente eliminado do lisossoma (comparar Figura 1a a 1b)....

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Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  Western University.  Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração. 

Vídeo: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Biologia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.