Name: Vídeo: Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00
Duration: 20 min

MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS foi apoiada pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030). JH foi apoiada pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS14-031).

1. Geração e funcionalização de Planar SLBS <ol><li> A mistura dos lípidos <ol><li> Para chegar a um SGD NTA-Ni / 90% CPPO composição lipídica de 10% dissolver 45 mg de POPC e 6,9 ​​mg DGS NTA-Ni em clorofórmio num frasco de 250 mL de fundo redondo. Manter o volume de clorofórmio baixo (apenas alguns ml) a evaporar-se no próximo passo. Para um SGD NTA-Ni / 99% CPPO composição lipídica 1% usar 49,5 mg de POPC e 0,69 mg de Ni-NTA DGS. </li><li> Remover o clorofórmio utilizando um evaporador rotativo lentamente - um aumento acima da temperatura ambiente não é necessário. Alternativamente, fundi-lo fora dentro de uma capa química numa corrente de gás inerte, tal como azoto ou árgon. Ao fazer girar este constantemente o frasco para permitir a deposição igual do lípido secagem na metade inferior do balão de fundo redondo. </li><li> Uma vez que a maior parte do clorofórmio é evaporado, anexar o frasco a vácuo O / N para remover o clorofórmio quantitativamente. NOTA: Esta etapa é fundamental para evitar a contaminaçãode proteínas e células com clorofórmio tóxico em fases posteriores e para garantir a fluidez bicamada lipídica. </li></ol></li><li> Geração de pequenas vesículas unilamelares (SUV) de lípidos secos Nota: Pequenas vesículas unilamelares (SUVs) situam-se entre 20 nm e 100 nm de diâmetro e podem ser facilmente produzidos por banho de sonicação. Lipid extrusão, um método alternativo, pode dar origem a SUVs e, dependendo do tamanho de poro do filtro aplicado por extrusão, também vesículas unilamelares grandes (LUV), que são de 100 nm a 1000 nm em tamanho. No entanto, SUVs são os mais adequados para a formação de SLBS. <ol><li> SUVs através de banho de ultra-sons (mostrado no vídeo): <ol><li> Degass PBS. Suspender a mistura de lípidos foi seca com 250 ml balão de fundo redondo em 10 ml de PBS desgaseificado. </li><li> Encher o balão com gás inerte tal como azoto ou árgon, fechá-lo com uma rolha e vedar o balão com uma fita de autoclave. </li><li> Colocar o balão selado, num banho de ultra-sons e sonicar a uma suspensão de lípidot 120-170 W até que ele se tornou clara. Isso leva entre 30 e 60 min. </li><li> Monitorizar o progresso da vesícula formação espectro-fotometria: resultar que a absorção da emulsão não diluída em comparação com PBS mantém-se constante a 234 nm (como um indicador adequado da concentração de lípidos) ainda deve diminuir significativamente a 550 nm (devido à redução da dispersão de luz através partículas maiores). </li><li> Para peletizar vesículas unilamelares não-pesados, que interferem com a formação de um SLB contígua, sedimentar a suspensão de vesículas por centrifugação, a 150.000 xg durante 1 h a 25 ° C e em seguida durante 8 horas à 288.000 xg, 4 ° C. </li><li> Filtra-se o sobrenadante através de um filtro de seringa com um diâmetro de poro de 0,2 um. </li><li> Medir a OD a 234 nm e 550 nm para monitorizar a clareza da preparação de vesículas e a quantidade de lípido esquerda. </li><li> Armazenar as vesículas a 4 ° C, sob árgon ou azoto. Opcionalmente, a suspensão de vesículas utilizar para a preparação em bicamadapor vários meses. </li></ol></li><li> SUVs através da extrusão de lípido: <ol><li> Em breve, passar a suspensão de lípido várias vezes através de um filtro com um tamanho de poro de 0,1 um. Independentemente do método de fabricação, Centrifugar a suspensão vesícula duas vezes (1H, 150.000, de 25 ° C; em seguida, 8H, 4 ° C, 288.000 g) para sedimentar vesículas unilamelares que não são mais pesados. NOTA: Quando armazenado a 4 ° C, sob gás inerte, as vesículas podem ser utilizadas para preparação em bicamada durante vários meses. </li></ol></li></ol></li><li> A formação de um SLB e carregamento com proteína <ol><li> Tratar 24 x 50 mm # 1.5 lâminas de vidro com uma mistura 3: 1 de ácido sulfúrico concentrado e 30% de peróxido de hidrogénio durante 30 min. NOTA: Devido à natureza agressiva da mistura ter um cuidado especial, ou seja, usar um jaleco e óculos de segurança, como mostrado no vídeo! </li><li> Lavar as lâminas de vidro sob uma corrente de ddH2O fora de uma garrafa de esguicho. Colocá-los em um carrinho de teflon e deixe-os secardurante 10 a 30 min. </li><li> Remova a lâmina de vidro de fundo de 8 ou 16 câmaras assim, preencher o fundo com cola epóxi e coloque cuidadosamente uma lâmina de vidro limpa e seca na parte inferior da câmara coberta de cola. Deixe a cola endurecer por cerca de 10 min. Remover o excesso de cola na parte inferior. NOTA: uma vedação estanque entre a lâmina de vidro e a câmara também pode ser facilmente conseguida com a utilização de um dentária de dois componentes pasta de modelagem de silicone, que endurece dentro de 10 a 30 min. Este selo não é tão firme como cola epóxi, mas resiste a tensão física regular. Após a experiência, pode ser facilmente removido da câmara, que é reutilizável, em seguida, em experiências futuras. </li><li> Pipetar 120 ul (60 uL) de uma suspensão de lípido 10 vezes diluído em PBS-cada poço de uma 8 (16) - bem câmara (preparado como descrito acima) e deixe que a forma bicamada, durante 20 min. Cuidadosamente lavar o bicamada duas vezes com 15 ml de PBS. Uma vez que a camada dupla é formada, ela deve estar sempre submersa no tampão e nunca ser exposta ao ar. </li&gt; <li> Encher cada poço todo o caminho com PBS, em seguida, tirar 330μl (8 poços câmara) ou 165μl (16 poços câmara). Existem 350μl (175μl) à esquerda no poço. Adicionar 50 ul (25 ul) de coquetel contendo proteínas marcadas com His diluídos em PBS a cada poço (400 ou 200 ul final) e incubar a temperatura ambiente durante 60 min no escuro. A densidade proteína de superfície pode ser ajustada através da variação da concentração de proteína durante este passo de incubação. </li><li> Lavar cada poço duas vezes com 15 ml de PBS. NOTA: Tipicamente, SLBS deve ser usada em experiências de não mais de 6 horas após a sua carga com proteína. Durante este período, a recuperação após fotobranqueamento fluoróforo permanece até 95% e sem perda de proteína associada a bicamada pode ser detectada. A densidade de proteína deve ser determinado antes da experiência (ver abaixo). </li><li> Passo opcional: Para testar a ligação não-específica da proteína do DGS NTA-Ni contendo SLB, lava-se a SLB uma vez com PBS contendo 300 mM de imidazole. O protein deve sair completamente. </li></ol></li></ol> 2. Setup Microscópio <ol><li> Para a construção de um sistema de microscopia capaz de detectar a fluorescência de fluorocromos individuais referem-se às recomendações foi referido na introdução. </li></ol> 3. Medições Elétricas NOTA: Os fluoróforos podem ser facilmente saturado com o excesso de luz de excitação. Isso acelera a fotodegradação sem ganho adicional na emissão e deve, portanto, ser evitado. Para optimizar a iluminação da amostra a densidade de potência de excitação deve ser medida directamente pelo espécime. Tais medidas podem também servir como uma referência para futuros experimentos. Além disso, conhecendo a relação entre a potência de entrada e de saída do laser é útil na avaliação, onde a luz é perdida no sistema de imagem. <ol><li> Mover o feixe de excitação para a posição vertical, de modo que deixa o objectivo em um ângulo de 90 °. </li><li> Coloque a cabeça do medidor de energia no topo of o feixe e medir a potência do feixe (= P). Documente o resultado. </li><li> Usando o periscópio, vire o feixe na posição TIRF e imagem de uma bicamada fluorescente homogênea intacta. Para evitar o branqueamento ea saturação do sinal CCD lugar uma densidade neutra (ND) filtrar com uma densidade óptica (DO) de 2-3 para o caminho de luz de excitação. <ol><li> Meça as contagens integradas de todo o campo iluminado (I = total). Além disso, medir o tamanho da área iluminada (= Um total). Medem-se as contagens integrados (= I Center) do ponto central maximamente iluminada, bem como o tamanho do ponto (= Um centro). </li></ol></li><li> Meça o sinal de fundo por pixel (= B), quer fora da área iluminada ou sem a iluminação da amostra. </li><li> Subtrair o sinal de fundo a partir dos resultados medidos em 3.). Faça isso multiplicando o número de pixels da área em questão (área toda iluminada ou ponto central) com o fundocontagens por pixel. (= I total - A .B total e eu centro - Um centro de .B). </li><li> Divida o integrado e de fundo corrigida do sinal do ponto central pelo sinal integrado e com correção de fundo de todo o campo de iluminação. NOTA: O resultado indica a fração do total de energia localizado dentro do ponto central (= (centro I - Um centro de .B) / (I total - A .B total)). A multiplicação desse resultado com o poder P medido em 2.) resulta no poder da luz que ilumina o ponto central. </li><li> Determinar o tamanho do ponto A no centro μm². Para este dividir o tamanho do pixel câmera em mm pela ampliação do objetivo, levar o quadrado do resultado como μm² por pixel. <ol><li> Alternativamente medir o tamanho do pixel na imagem com o uso de uma lâmina de micrómetro colocado no microscópio e tomar o quadrado do resultado, como a área por pixel. Multiply este valor pelo número de pixels localizados no interior do ponto central para chegar à área do ponto iluminado. </li></ol></li><li> Dividir a potência P iluminando o local central por o tamanho do ponto central um centro, μm² para calcular a intensidade de iluminação por 2 uM. Um exemplo é dado na figura 6. </li><li> Os valores de densidade de energia medido em TIRF iluminação não são normalmente mais baixos do que aqueles presentes em TIRF iluminação 13, que também dependem do ângulo exacto em que a luz laser é totalmente reflectida. Para chegar a densidades de energia presentes sob iluminação TIRF, imagem calibrado partículas fluorescentes de 0,1 um de diâmetro tanto na não-TIRF e TIRF. O rácio de intensidades de fluorescência do grânulo medido em TIRF e modo não-TIRF eleva-se o factor de conversão de C, que permite a conversão de valores de densidade de potência medidos para aqueles eficaz sob TIRF iluminação (equação 1). densidade de potência </em&gt; TIRF = C • densidade de potência não TIRF (equação 1) com C = intensidade talão T IRF / intensidade talão não-TIRF </li></ol> 4. medições de densidade <ol><li> Determinar o sinal médio de fluoróforos individuais localizados em uma bicamada. Moléculas MHC ligado à bicamada carregados com peptídeos fluorescentes são ideais para esta finalidade desde a proteína: Etiqueta estequiometria é exatamente um. Se necessário lixívia todos os rótulos no bicamada no campo de visão e deixar a fluorescência recuperar para visualizar fluorophores individuais. <ol><li> Gravar imagens em rápida sucessão (por exemplo, aplicar uma aquisição Streaming Protocol) e monitorar moléculas individuais de mobilidade ao longo de vários quadros. Para mais informações consulte a Figura 7. </li></ol></li><li&gt; Marque o ponto de iluminação central dentro da bicamada como ROI. Medir o ROI, a variação na densidade de potência de iluminação (que é proporcional à intensidade da fluorescência) deve ser idealmente inferior a 15%. <ol><li> Determinar molécula única e fluorescência em massa apenas no interior desse ROI. Integrar o sinal de uma ROI, que é grande o suficiente para capturar 99% ou mais da função de ponto de propagação do único emissor. Ao empregar uma câmera com um pixel tamanho de 16-20 mm (indicado na especificações da câmera do fabricante), um objectivo com ampliação de 100 vezes e uma abertura numérica igual ou maior do que 1,45, levar uma região de 7 por 7 pixels com o pico de intensidade localizado no centro da praça. </li><li> Para determinar o sinal de fundo, integrar as contagens de um quadrado 7 por 7 pixel vizinho, que não contém um sinal de fluorescência. Subtrair o fundo do sinal de molécula única para determinar o valor corrigido para única molécula de fluorescence. Selecione apenas sinais, que ainda são visíveis no seguinte quadro. </li></ol></li><li> Repita o passo 4.2 cinqüenta a várias centenas de vezes. Em média, o sinal corrigido-fundo. Se desejado, traçar valores de intensidade única molécula como um histograma. Opcional: tirar proveito de um plugin adequado de pacotes de software de código aberto (por exemplo, ImageJ) ou processar os dados utilizando software comercial (por exemplo Metamorph, Molecular Devices). Os usuários experientes podem escrever seu próprio programa de análise em Matlab ou pacotes de software semelhantes. </li><li> Colocar um filtro de densidade neutra de 2 ou superior para o caminho de excitação e tirar fotos de uma bicamada fluorescente contendo proteínas marcadas com o mesmo fluoróforo. Grave a intensidade média dos pixels dentro da mesma ROI usado para medições individuais intensidade molécula. Grave o tempo de exposição das medições de fluorescência a granel. Medir o mesmo lugar sem iluminação de fundo subtração. </li><li> Para determinar a densidade de proteína dentro do bicamada, multiplique a maior intensidade de fluorescência de pixel média com correção de fundo determinado no passo 4, pelo número de pixels por micron quadrado (por exemplo 41,5), por 100 (se um filtro ND com um OD de 2 foi empregado) ou 1.000 (se for um ND Filtro com uma DO de 3 foi usado) e o tempo de exposição utilizado no passo 2 e dividi-lo por o sinal de média única molécula determinado no passo 3, o tempo de exposição utilizado no passo 2 e o número de fluoróforos por proteína. </li></ol> 5. testar a integridade da bicamada <ol><li> Prepara-se uma camada dupla fluorescente e colocá-lo sobre a platina do microscópio como descrito acima. </li><li> Ajuste o foco e ter uma imagem da bicamada no modo TIRF. Aplicar um pulso lixívia curta, mas intensa no modo não-TIRF para retirar a fluorescência dentro de um pequeno ROI em forma de disco. </li><li> Aqui uma imagem da bicamada no modo de baixa intensidade TIRF imediatamente após o branqueamento e, em seguida, cada cinco a dez segundos para monitorar a velocidade de recuperação de fluorescência. </li><li> Move para uma área diferente na bicamada e siga o passo 2 e 3. Tome uma outra imagem em modo de baixa intensidade TIRF 5 min após o pulso lixívia. Determinar a intensidade I pós lixívia na área de lixívia e compará-la com a intensidade antes do branqueamento 0 I no início da experiência (sem branqueamento deve ter ocorrido) para calcular a fracção imóvel (IF) como se segue: Fração Immobile IF (%) = (I 0 - eu postar lixívia) / (I 0 - fundo) x 100, com fundo = intensidade medida dentro do ROI sem luz de excitação aplicada O IF deve ser inferior a 10% (de preferência menos de 5%). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

Microscopia molécula única proporciona a oportunidade única de estudar o comportamento de proteínas dentro de seu ambiente nativo celular. A imagem molecular torna-se, portanto, cada vez mais atraente para uma ampla comunidade científica, mas muitos cientistas de vida ainda coíbe de o investimento inicial em tecnologia e conhecimento. A principal vantagem resultante da montagem do próprio sistema de imagem é que ele pode ser facilmente ajustado com a necessidade específica de qualquer um. Tal como aqui sugeriu uma TIRF-non feixe de excitação pode ser facilmente aplicadas, para além de um caminho de luz TIRF existente, se foto-branqueamento rápido e definido (ou -activation) de fluoróforos e ligantes é desejada, por exemplo, ao realizar experimentos FRAP ou ligando uncaging 14 . A introdução de um divisor de feixe de emissão permite a gravação simultânea de pelo menos dois e, em alguns casos até quatro canais fluorescentes. A lista de extensões é, em essência, limitado apenas pelaa própria imaginação. Por exemplo, a implementação de uma roda de filtro de emissão motorizada no caminho de emissão permite a comutação rápida entre até dez canais fluorescentes diferentes. Ao combinar duas rodas motorizadas filtro de emissão (cada um equipado com ranhuras de filtro 10) em série, até 18 canais fluorescentes podem ser lidas. Imagens baseadas em TIRF pode ser complementada com medidas de mobilização de cálcio e Interferência Reflexão Microscopia (IRM) após a integração de um caminho de lâmpada Xenon de excitação ou Mercury. IRM é o método de escolha para visualizar o grau ao qual as células estão ligadas à superfície de vidro ou um SLB e pode, portanto, fornecer informações críticas na interpretação dos dados de imagem à base de TIRF. O estabelecimento de um feixe de excitação alargada com a utilização de um espelho dicróico simples e um laser de 405 nm adicional permite a realização de microscopia de fotoactivação localização (Palm) ou microscopia óptica reconstrução estocástica (Storm), isto é, dois superresolutmetodologias de iões com uma precisão posicional abaixo do limite de difração da luz visível 15,16. No entanto, o sucesso experimental não é apenas uma questão de hardware apropriado. Para tirar o máximo proveito de imagem baseado em TIRF reduzido ruído, as células devem fazer contato com uma superfície de uma forma que não imponha restrições na superfície da célula ou que interfira com a fisiologia da sua membrana plasmática. SLBS funcionalizado com proteínas adequadas para adesão celular estão superando bem adequado para esta finalidade, pois todos os ligantes SLB-incorporados são lateralmente móveis e ajustar a sua posição lateral dentro da bicamada em resposta ao receptor dinâmica de ligação e de segregação. Para fabricar SLBS de forma reproduzível, o melhor é começar com veículos utilitários esportivos de alta pureza. Tal como aqui descrito, é, portanto, essencial para remover vesículas multilamelares, que também são produzidas durante a sonicação, em dois passos de ultracentrifugação como estes interfere com a formação de SLBS contíguos caracterizam elevada fluidez. SLBS de forma alta qualidade apenas em superfícies de vidro limpo. Uma vez que as lâminas de vidro limpas deve ser utilizado imediatamente ou armazenado em vácuo. Importante, SLBS não deve nunca ser exposta ao ar, pois isso levaria a sua interrupção. SLB envolve a lavagem, tal como mostrado, com tampão de lavagem a utilização de uma pipeta serológica, como este é não só um processo mas também economizar poupar tempo. Durante a colheita e purificação de proteínas residentes SLB a utilização de detergentes deve ser evitada. Isto é porque o detergente irá reduzir significativamente a mobilidade da proteína, mesmo quando presentes em quantidades vestigiais. Para contornar a necessidade de detergente todos juntos, expressão solúvel de poli-histidina secretado ligantes equipada tag é recomendado em células de mamíferos ou de insectos. Se o re-enrolamento a partir de corpos de inclusão de E. coli é necessário, cuidado deve ser aplicado para remover detergentes eficaz a partir dos corpos de inclusão antes da sua un- e redobragem. Uma vantagem principal de empregar SLBS resultados da sua natureza modular e de reconstituição, que permite especificamente para dissecar o papel de uma interacção ligando-receptor dado para a activação da célula e adesão celular. A este respeito, é importante mencionar que os SGD NTA-Ni deve estar presente em 10% dentro do SLB, a fim de impedir que as proteínas que competem para locais de ligação de NTA-Ni. Quando se emprega SLBS albergando apenas 1% ou 2% DGS NTA-Ni, uma redução na associação das dada uma espécie de proteína marcada com poli-histidina podem ser notados, especialmente quando co-incubação de quantidades crescentes de uma segunda espécie de proteína de poli-histidina marcada com (não publicado observação). Este fenômeno não é observado quando se trabalha com SLBS caracterizam 10% DGS NTA-Ni. Embora nunca tenham observado a ligação não específica de proteína de poli-histidina de qualquer marcadas testados para SLBS contendo DGS NTA-Ni, esta possibilidade deve ser ensaiada por ocasião da introdução de uma proteína para o primeiro tempo,Para este fim, recomendamos o uso de SLBS desprovidas de DGS NTA-Ni (a proteína não deve ligar). Em segundo lugar, quando se usa uma SLB contendo DGS NTA-Ni, a proteína deve sair completamente depois de lavar o SLB com PBS contendo 300 mM imidazol. Outra vantagem significativa dos empregando SLBS é que as interacções transientes e eventos de sinalização pode ser monitorada com uma melhor resolução espaço-temporal 17-19. Isto é, pelo menos, em parte por causa de um processo de ligação tridimensional é essencialmente reduzida a duas dimensões de imagem, especialmente quando se grava em modo TIRF ruído atenuado. O uso de SLBS é compatível com a detecção de sinais única molécula, um pré-requisito para a microscopia activado foto-localização (PALM) ou estocástica microscopia óptica reconstrução (STORM), microscopia SuperResolution ou seja, com uma resolução abaixo do limite de difração 15,16. Essas modalidades de imagem especiais permitem única molécula Förster Ressonância Energia Traexperimentos nsfer concebido para visualizar as interacções proteína-proteína individuais num ambiente sináptica 20. Esta abordagem é explicado em detalhe considerável em uma publicação JoVE 21 denominado &quot;Medição de ligação utilizando um ensaio com base em microscopia de TCR-pMHC FRET&quot;. Ao interpretar experimentos baseados no SLB deve-se sempre ter em mente que nem todas as propriedades de uma membrana plasmática de uma célula viva são caracterizados por SLBS, e que algumas das qualidades que faltam pode afetar a fisiologia sob investigação. Afinal, proteínas SLB-incorporados são livremente difundir e não organizados em microdomínios de membrana como a maioria dos seus homólogos celulares são 5,6,22. Folhas de membrana de plasma imobilizadas derivadas de células aderentes, que conservam a arquitectura da membrana plasmática de células vivas em algum grau, foram empregues com sucesso para estudar a absorção de antigénios de membrana incorporado por linfócitos-B 23. Contudo, mesmo taismembranas não interagem com um citoesqueleto altamente dinâmico e apresentam nenhuma flexibilidade como eles são apoiados por uma superfície de vidro rígida. Tendo em conta estas discrepâncias, há claramente uma necessidade de SLBS engenharia, que oferecem meios para compartimentar as proteínas de uma forma definida e que são apoiados por superfícies de flexibilidade ajustável ou por superfícies que mudam a sua rigidez em resposta a pulsos de luz aplicados localmente.

Compreender os mecanismos pelos quais as proteínas da membrana cumprem a sua função celular muitas vezes pode ser uma tarefa desafiadora, porque os seus modos de ação são frequentemente definidos por interações de baixa afinidade, que são difíceis de detectar e avaliar por metodologias bioquímicas convencionais. Proteínas de membrana pode ainda ser altamente enriquecido em domínios específicos de membrana 5,6 ou formam dinâmicas estruturas de ordem superior, que podem, em princípio, alterar a sua actividade biológica 7. Microscopia única molécula de fluorescência assistida por laser não-invasivo tornou-se assim a metodologia de escolha para estudar o comportamento de proteínas celulares em ambientes complexos. Isto é particularmente verdadeiro no caso de processos bioquímicos que ocorrem na membrana plasmática, pois estes podem, em princípio, ser monitorado no modo de redução de ruído reflexão interna total (TIRF). Aqui a iluminação da amostra se restringe a uma fatia de até 200 nm-fino em estreita proximidade com um copo surface, o que resulta em uma perda significativa no fundo celular e, devido às características da luz de excitação evanescente, também num aumento substancial na intensidade de fluorescência de sinal de 8,9. Ambos os aspectos são importantes quando se aponta em alta resolução posicional e temporal na detecção molécula única. Planar SLBS não só são compatíveis com microscopia TIRF. Quando funcionalizado com ligantes apropriados eles também fornecem acesso directo ao estudo das dinâmicas moleculares de reconhecimento célula-célula à medida que ocorrem em células imunes ou outras células. Eles também podem ser simplesmente utilizada para posicionar células móveis e de outra forma não-aderentes suficientemente perto da placa de vidro de modo a que tais células podem ser visualizados na iluminação TIRF, o que é altamente desejável quando as experiências de condução envolvem único rastreamento molécula ou única SuperResolution à base de molécula. Para este fim as proteínas têm de ser carregado numa SLB altamente móvel. Uma vantagem inerente do Li usadas<html> PIDs são de que não há nenhuma ligação não específica de proteínas em tudo. Além disso, SLBS podem ser consideradas como líquidos bidimensionais com uma capacidade inerente de curar-se; irregularidades no âmbito do suporte de vidro são compensados ​​até um certo grau. Um protocolo passo passo é fornecida para gerar bilayers altamente móveis carregadas com proteínas de interesse. A formação de SLBS planares está descrito, que contém de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como o ingrediente principal (90-99%) e o lípido sintético e funcionalizado 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} sal de níquel (Ni-NTA DGS) em baixa abundância (1-10%). POPC transporta um ácido gordo saturado e um ácido gordo mono-insaturado e formam bicamadas lipídicas de elevada fluidez, mesmo à temperatura ambiente. DGS NTA-Ni liga-se com a sua headgroup para caudas de poli-histidina e serve como âncora para proteínas poli-histidina-tag de escolha (Figura 1). &quot;&gt; Importante, o hardware microscopia deve incluir um certo número de periféricos que são descritos abaixo. Com a informação fornecida e algum conhecimento básico em óptica e física do laser, qualquer biólogo deve ser capaz de construir uma configuração única molécula de imagem. Amostra de excitação deve ser idealmente realizada em um microscópio invertido em modo de reflexão interna total (TIRF) como este regime reduz a luz espúrias e fundo excessivo resultante de outra forma a partir celular auto-fluorescência 9. Para isso, um objectivo especial TIRF-capaz (ver abaixo) e iluminação do laser são necessários. Algumas experiências requerem tempos de iluminação dentro da gama milissegundo e operado em sucessão rápida. Para poupar tempo de iluminação ou para evitar branqueamento desnecessário causado pela iluminação repetitivo é muitas vezes útil para dividir a luz emitida em dois ou mais canais espectrais. Isto permite a leitura simultânea de dois ou mais perfis de emissão, o que pode tornar-se um factor significativo quando conducexperiências ting envolvendo Transferência Förster Ressonância Energia (FRET). Aqui a emissão resultante do único pulso de luz de excitação podem ser gravados tanto do doador FRET FRET e receptor (como emissão sensibilizados). A câmera deve capturar fótons suficientes com fundo suficientemente baixo para visualizar fluorophores individuais durante o tempo de iluminação. O software de computador terá que ser à altura da tarefa de sincronizar fechamento de excitação e de aquisição de imagem. Uma visão global é dada abaixo e na Figura 2: Objectivo TIRF capaz-: Para a iluminação baseadas em TIRF objectivo a abertura numérica (NA), o objectivo deve ser igual a ou maior do que 1.4, utilizando lâminas de vidro padrão (n = 1.515) 9. A ampliação pode variar entre 60x a 150x. O objetivo deve ser cromaticamente corrigida para permitir confocalidade quando imagiologia diferentes fluoróforos. Lasers: O número de lase disponívelOpções r tem aumentado significativamente nos últimos anos. Modern eletronicamente moduláveis ​​lasers de diodo de onda contínua são eficientes em termos de custo e pode ser operado com frequência e velocidade sem precedentes. Lasers de iões de gás mais caros se destacam em qualidade de feixe laser, mas exigem fechamento externo (ver abaixo) e, muitas vezes extensa (água) de arrefecimento. Persianas Excitação: moduladores acusto-ópticos (OMA) permitem fechamento rápido em rápida sucessão 10. Para apertado fechando a combinação de um AOM com obturadores mecânicos é recomendado. Desta forma extensa aquecimento da OMA devido à exposição à luz contínua é evitada e luz vazando da OMA no off-posição é cancelada. As lentes são usadas para alargar a feixes de laser e para concentrá-los no plano focal de trás da objectiva. Desta forma, a luz de excitação deixa o objectivo como um feixe paralelo (Figura 3), que é necessária para a iluminação de TIRFa amostra. Movendo-se o ponto focal no interior do plano focal posterior a partir do centro para a periferia do objectivo vai mudar o ângulo a que o feixe deixa o objectivo, mas não o local do ponto de laser na amostra (Figura 3), que é uma função da geometria global do feixe. Iluminação TIRF segue a um ângulo critico, que pode ser ajustada através de um conjunto de espelhos que funcionam como um periscópio para traduzir o ponto focal do laser no interior do plano focal da objectiva. Lentes devem ser cromaticamente corrigida e pode ser usado em um conjunto de dois ou três lentes. Um sistema de três lente consiste de duas lentes que actuam como um telescópio para alargar o feixe de laser (e, portanto, o ponto de iluminação na amostra) e uma terceira lente para focar o feixe alargada para o plano focal posterior da objectiva (Figura 4). Ambas as funções (telescópio e de focagem) pode também ser conseguida por uma combinação de apenas duas lentes (ver Figura 4). Espelhos deve ser de pelo menos 95% reflectora para evitar a perda de luz laser. Para cada feixe ajuste de um conjunto de dois espelhos é normalmente aplicado como tal arranjo é suficiente para ajustar precisamente qualquer ângulo e a posição de um feixe de laser. Sobreposições dicróicas refletir e transmitir a luz de diferentes comprimentos de onda específicos e são utilizados para sobrepor ou dividir as vigas de dois lasers. Polychroic filtros são mais complexos do que os filtros dicróicas e são necessários para refletir a luz de excitação de entrada e transmitir sair emissão de luz a partir da amostra. Eles são colocados no cubo de filtro entre a lente objectiva e o tubo de microscópio. Limpar filtros: Dependendo do tipo de employe a laser d laser de limpar os filtros com uma largura de banda de transmissão estreita deve ser colocado para o raio laser logo após ele deixa a laser. Filtros Notchsão projetados para absorver de forma eficaz luz laser com uma largura de banda estreita e transmitir toda a outra luz. Eles são colocados no caminho de emissão para filtrar qualquer luz de excitação laser de espúrio. No entanto, os filtros notch trabalhar apenas a 0 ° de ângulo de entrada. Se a largura de banda-do filtro de corte é muito afiada, os diferentes ângulos de entrada não pode ser refletida mais. Bloqueio de luz laser a laser colimado não é afetado, mas a luz back-dispersa não pode ser eficazmente impedida de alcançar a câmera. Rodas de filtros motorizados equipados com rodas de filtros adequados podem ser facilmente colocados na via de excitação e de emissão e permitir a comutação simples entre diferentes intensidades de luz (quando equipado com filtros ND) ou canais fluorescentes (quando colocado em frente de um xénon ou lâmpada de mercúrio de arco para raciométrica Imagem de cálcio ou na frente da câmera para selecionar para o fluoróforo emissor de luz). 50:50 cubo divisor de feixe cum ser usado para dividir em dois feixes de laser percursos dos feixes de excitação separada e também para combiná-las em frente de periscópio. Divisor de feixe (trajeto de emissão): Para a aquisição rápida de imagens sem qualquer necessidade de troca de filtros físicos, o feixe de emissão é dividido em um canal de azul-vermelho-deslocada e deslocada. Em princípio, divisores de feixe pode ser construída através da utilização de uma cunha dicróico ou um conjunto de espelhos e um espelho dicróico para separar o feixe de emissão de um modo dependente do comprimento de onda. Dois filtros de emissão são necessários para limpar os canais emitidos. Filtro espacial: a filtragem espacial do feixe de excitação é por vezes necessária para remover os raios de luz não paralelos emitidos a partir de feixes de laser de baixa qualidade. Um filtro espacial consiste de um telescópio de duas lentes com um pequeno orifício colocado exatamente no ponto focal de ambas as lentes. Esta luz espúrias maneira resultante a partir de porções não-paralelas de o feixe de laser torna-se eficientemente bloqueados. Such condições devem ser atendidas ao estabelecer microscopia baseado em TIRF. Filtragem espacial aumenta com orifícios mais pequenos, que são mais difíceis de posicionar no ponto focal, e com distâncias focais menores da primeira lente. Para reduzir os efeitos causados ​​por aberrações da lente é vantajoso empregar em vez de lentes simples de alta qualidade e os objetivos do microscópio corrigido ao infinito com baixa ampliação (10x ou 20x). Periscópio: Uma configuração de periscópio é necessária para converter o feixe de laser focado no plano focal posterior do objectivo, um pré-requisito para imagiologia TIRF. Ele pode ser facilmente construído a partir de dois espelhos de duas polegadas, um estágio de translação para ajustar o primeiro espelho e um posto para o posicionamento do segundo espelho para reflectir o feixe focado e alargado de excitação para o microscópio (Figura 5). Câmera: retro-iluminado Electron Devices Multiplicando-Charge Coupled (EMCCD) são rotineiramente usados ​​paraa gravação de sinais de moléculas individuais. Isto é devido à sua elevada eficiência quântica (até 95%), elevada velocidade de aquisição (até 30 MHz) e comparativamente baixo ruído. Arrefecendo-se a -80 ° C, reduz o ruído térmico e é suportada por um certo número de câmaras EMCCD actualmente disponíveis. A limitação da tecnologia EMCCD é que o ruído da câmera aumenta linearmente com o tanto o ganho da câmera eo sinal a ser capturado. Este não é o caso com CMOS (scmos) câmaras científicas, que são significativamente menos dispendiosos e funcionam devido à arquitectura especial do chip scmos também muito mais rápido do que as câmaras EMCCD. No entanto, um problema associado com a tecnologia CMOS é que a aquisição da imagem ainda carece de algum grau de uma leitura quantitativa em um único nível molécula, porque cada pixel apresenta diferente sensibilidade de detecção. Em princípio isto pode ser compensado por meio de pixel normalização, mas este processo não é de forma triviais 11. É por isso que ainda hesitam em reRecomendo câmeras scmos para microscopia molécula única, mas tendo em vista o rápido desenvolvimento desta tecnologia, as câmeras scmos pode em breve se tornar a câmera de escolha. Câmeras CCD de varredura lenta câmeras evitar ruído e de pixel variância relacionada amplificação-todos juntos e apoiar taxas de aquisição de mais rápido se eles podem ser operados em um modo chamado &quot;cinético&quot;. Neste modo, o chip inteiro de câmara excepto para uma região de interesse (ROI) é mascarado, o que faz com que seja possível utilizar o próprio chip como um dispositivo de armazenamento. Após a ROI é exposta pela primeira vez, as cargas resultantes são deslocadas para a área mascarada da linha de pixel do pixel de chips por linha, em que a imagem está protegida da exposição à luz adicional. Uma vez que a mudança de todas as linhas do ROI na região mascarada está concluída (na gama de sub-milissegundos), o próprio ROI está pronto para a próxima exposição. Este ciclo é repetido até que todas as linhas de pixels do chip CCD estão carregadas. O chip é então lido para fora lentamente com marcadamente reduruído de leitura ced. Por exemplo em um chip de pixel 1000 x 1300, 20 ROIs de 50x50 pixel pode ser gravado em rápida sucessão. Uma vez que as imagens permaneçam no chip durante um tempo considerável, antes de ser lido, é crítico para assegurar o mascaramento de alta qualidade e para arrefecer a câmara (por exemplo, com azoto líquido) na forma de um meio para reduzir o ruído térmico excessivo. Algumas câmeras EMCCD também suporta o modo de cinética. Software: O sincronismo dos lasers, persianas, OMA e exposição da câmara, bem como armazenamento de imagem adequada são parte integrante de qualquer experimento de imagem bem sucedida. Em princípio, muitas operações definidas pode ser programado com pacotes de software disponíveis que vêm com a câmera. Pacotes de software comerciais apoiar um grande número de periféricos de hardware, que podem ser implementados com pouco know-how técnico. Gerador de pulso, Aquisição de Dados (DAQ) placa (com canais analógicos e saídas digitais) e osciloscópio: Um gerador de pulso é umexcelente escolha para converter impulsos de disparo em impulsos de tensão e de tempo definido. Desta forma, lasers pode ser controlada com precisão para potência de saída e cronometrado no milissegundo a gama sub-milissegundo. DAQ com placas de saídas analógicas alcançar o mesmo e são facilmente integrados na placa-mãe do computador através de slots PCI. A duração do impulso, amplitude e frequência são verificados com um osciloscópio. Protecção de todo o caminho do feixe de excitação: Para evitar flutuações no perfil de excitação devido a convecções ar o caminho inteiro feixe de excitação deve ser fechados a partir do seu ambiente de laboratório. Esta medida é especialmente importante quando a realização de microscopia TIRF. Os componentes ópticos também estão protegidos contra a poeira e o olho humano da exposição à luz laser. Os compartimentos podem ser facilmente construir a partir da placa de cartão preto, que pode ser comprado em lojas de materiais de artes. Para determinar a fluidez da recuperação SLB fluorescência após Photobleaching medições (FRAP) 12 são executadas. Para FRAP a existência de dois percursos dos feixes de excitação é aconselhável (ver Figura 3). O primeiro percurso de feixe é concebido para a imagem da fluorescência da bicamada. Isto pode ser feito na configuração TIRF e com baixa intensidade de luz. O segundo percurso de feixe deve permitir a um pulso curto lixívia mas intensa e deve ser configurado de modo não-TIRF, de modo que deixa o objectivo ao longo do eixo óptico. Uma abertura redonda pode ser colocada no caminho do feixe de excitação (ver Figura 8) para projectar um perfil de lixívia perfeitamente redondo com arestas definidas. A fim de imagem desta abertura para o plano do objecto, da sua posição óptima seria no plano focal da lente 3 (ver Figura 3). No entanto, devido à grande distância focal desta lente, uma imagem com qualidade suficiente abertura pode também ser gerada, quando a abertura é colocado em posições ligeiramente deslocada. Depois de ter realizado tele imagiologia de experiência os dados em bruto deve ser analisada de forma adequada. Vários protocolos passo-a-passo são oferecidos, que cobrem o ajuste das configurações principais (por exemplo, energia e iluminação de tempo, ângulo TIRF), aquisição e análise dos dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ml round bottom flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>201-1357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50:50 beam splitter cubes</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BS013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-opitcal modulator C1205-2</td>
			<td>Isomet</td>
			<td>-</td>
			<td>only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-NHS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>489-1312</td>
			<td>or any other heat-stable sticky tabe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td>alternative to the bath sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator QSONICA Q700</td>
			<td>QSONICA</td>
			<td>Q700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beam splitter</td>
			<td>Cairn</td>
			<td>P280/210/MLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;chi rotary evaporator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>531-0837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td>see manuscript text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentarted hydrogenperoxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9683.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated sulfuric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X944.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epoxy glue</td>
			<td>Uhu</td>
			<td>45705</td>
			<td>Uhu plus sofortfest 2min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter wheel</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>Lambda 10-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek chambers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser&#160;</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>-</td>
			<td>different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens</td>
			<td>Thorlabs, Newport</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGS NTA-Ni (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>790404C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (lipid)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>already in Choroform-solved delivered version is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical filters</td>
			<td>AHF, Chroma, Semrock</td>
			<td>-</td>
			<td>filter sets are available for many different combinations of dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>BK Precision&#160;</td>
			<td>2120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>degas before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periscope</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>picodent twinsil 22</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13001000</td>
			<td>alternative to the epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power meter Lasermate-Q</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>-</td>
			<td>any powermeter sensitive in the used spectral range will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse generator</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SRS DG535&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatial filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KT310/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440782-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloromethane/chloroform</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3313.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>45237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ultracentrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RC M150GX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S120-AT2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV spectrophotometer Nanodrop 2000c</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>181-0248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

A arquitectura do sistema único de microscopia de fluorescência molécula é descrito em considerável detalhe na Figura 2. As peças individuais, tais como componentes ópticos e outros componentes de hardware são explicados na introdução. Os percursos dos feixes ópticos de excitação, que dão origem numa forma definida para TIRF e TIRF não-iluminação, são mostrados e explicados nas figuras 3 a 5. Note-se a localização do divisor de feixe 50:50 em frente do primeiro espelho periscópio posicionado sobre uma fase traduzível micrómetro (Figura 5). Este divisor de feixe sobrepõe o feixe TIRF utilizado para imagiologia (indicada a verde) e o feixe não TIRF (indicados a vermelho) usado para o branqueamento ou luz mediada por activação de amostra definida pelo local de abertura (como descrito na Figura 3). Os caminhos combinados leve (Figura 5, indicadas na laranja) são reflectidos por meio do segundo espelho periscópio na porta traseira do micr invertidooscope. Tal como foi explicado na Figura 4 e descrito na Figura 2, da aplicação de dois ou três lentes convexas alarga os perfis de raios laser e concentra-se os feixes de laser sobre o plano focal posterior da objectiva para dar origem a dois feixes colimados iluminar a amostra em TIRF e , respectivamente, em não-TIRF. Um exemplo de valores de intensidade medidos necessários para calcular a densidade de potência na amostra é mostrado na Figura 6. A média do sinal de fundo a ser subtraído a partir de intensidades medidas na área iluminada e central (utilizado para imagiologia), é determinado de uma região no interior da campo de visão, que não está iluminada pelo feixe de laser (7089 contagens aqui). As intensidades corrigido-fundo médios dos iluminados (1684 pontos) ea área central (4830 pontos) são então multiplicados pelos tamanhos das regiões correspondentes para dar origem a intensidades integradas (1,4718 x 10 contagens para a área iluminada e 3,424 x 10 7 a contagem para a área central). A relação das intensidades integradas dentro das regiões central e iluminadas produz a fração do poder global iluminando a área central (0,23 ou 23%). Como mostrado no filme, a potência total tem que ser determinada no objectivo com o uso de um medidor de energia em modo de iluminação não TIRF. No nosso exemplo, isso é ajustado a 5 mW, dando assim origem a uma força de 5 mW x 0,23 = 1,15 mW dentro da área central. Uma vez que 41,5 pixels montante no nosso exemplo 1 para 2 uM, a zona central tem um tamanho de 7089 pixels /41.5 pixels x 2 ^ m = 2 170,8 uM. Dividindo-se o poder da luz que ilumina a área central (1,15 mW) por esta região (170,8? M 2) produz uma potência médiadensidade de 0,7 kW / cm2 no interior da zona central. A Figura 7 apresenta imagens e resultados de intensidade correspondentes de fluorophores individuais adquiridos em rápida sucessão (100 quadros por segundo, ou seja, com um prazo de 10 ms). Para a quantificação da intensidade média do sinal de uma região rectangular de sete em sete (49) = pixels, que abrange o sinal de fluorescência, é determinada. Além disso a média do sinal de fundo é determinado dentro de uma região rectangular de sete por sete pixels em estreita proximidade do sinal de molécula única. A média do sinal corrigido-fundo é multiplicado pelo número de pixels dentro da região (= 49) para dar origem ao sinal de molécula única (em negrito). Uma experiência representativa FRAP concebido para avaliar a mobilidade de proteínas marcadas por fluorescência SLB-associados é mostrado na Figura 8. Note na Figura 8A a repetitiva uso de um feixe alargado de imagem baixa intensidade e do uso individual de um segundo mais estreito e abertura definida feixe de alta intensidade para ablação fluorocromo rápido no segundo ponto de tempo zero. Intensidades médias subtraído-secundário no interior do círculo amarelo, que foram normalizados pelo valor de intensidade média inicial antes do impulso de branqueamento, são traçados na Figura 8B contra o tempo para gravar a velocidade e extensão à qual a fluorescência foi recuperado. Como se mostra, mais do que 90% (indicada pela linha verde) da intensidade inicial bicamada recuperou dentro de 75 seg depois da ablação fluorocromo. Como consequência menos de 10% das proteínas incorporadas na SLB mostrados são imóveis. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Figura 1. esboço esquemático de um sistema de SLB. (A) SLBS são feitos de POPC (90-99%) e o lípido sintético DGS NTA-NI (1-10%). Eles formam espontaneamente quando superfícies de vidro limpas são acusados ​​de SUVs que consistem nos lípidos correspondentes. (B) Uma vez formados, esses SLBS pode ser facilmente decorado com proteínas solúveis estendidos ou com uma tag C- ou N-terminal contendo doze histidines (12H, para exemplo a molécula co-estimuladora B7-1 e a molécula de adesão dímeros ICAM-1) ou proteína estendido com duas etiquetas contendo seis histidinas cada (2x6H, por exemplo, um dímero αβMHC classe II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Lasers Figura 2. Visão geral dos caminhos de excitação e de emissão de feixe de íons. Gas (por exemplo Ar + ou Kr +) pode ser operado para fechamento rápido com o uso de acousto mo óptica<html> dulators. Lasers diodos são hoje disponível em vários comprimentos de onda e representam uma excelente alternativa como eles podem ser modulada eletronicamente no microssegundo-raiva. Note-se que os raios laser pode ser facilmente ajustada com dois espelhos (dicróicas) e divididos e combinados com a utilização de separadores de feixe simples para dar origem a dois ou mais trajectos de feixe. Neste exemplo, um feixe de imagem TIRF (para monitorar os eventos) e um feixe de água sanitária (para tanto fluorophores lixívia ou foto-ativam moléculas criadas em gaiolas em uma forma definida de abertura) são utilizados. Ambos os caminhos de excitação podem ser operados independentemente um do outro através da utilização de persianas adicionais. O periscópio permite traduzir os feixes de laser focalizado no plano focal de trás do objetivo de gerar iluminação TIRF da amostra. A imagem fluorescente pode ser dividida espectralmente com o uso de um divisor de feixe de emissão antes da aquisição com a utilização de uma câmara de ultra-sensível (por exemplo, EM-CCD ou CMOS câmara Scientific)..com / files / ftp_upload / 53158 / &quot;target =&quot; _ blank 53158fig2large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figura 3. Ajustar iluminação TIRF ao traduzir o feixe focado no plano focal posterior da objectiva. Como mostrado o ponto focal do feixe de raios laser é deslocada no interior do plano focal posterior do objectivo do centro para a periferia através da translocação do feixe (usando um arranjo espelho periscópio). Como resultado, um feixe paralelo deixa o objectivo de uma iluminação inclinada até um ângulo crítico é atingido no qual a reflexão interna total ocorre. O campo evanescente é gerado na interface vidro-media onde reflexão total ocorre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta fi</a><html> gura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figura 4. sistemas ópticos simples para focar o feixe de laser para o plano focal posterior da objectiva. Três ou duas lentes são necessários para alargar o feixe de laser e para concentrá-lo no plano focal posterior do objectivo TIRF. Dois sistemas de lentes contêm menos erros associados a lente do que os sistemas de três lentes e poderia ser mais adequado para gerar o feixe de imagem TIRF. Três lentes pode ser preferível quando se aponta para a ampliação feixe definido e um local de iluminação com bordas afiadas, como seria necessário para estudos que empregam foto-ativação ou -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. anotada fotografia do caminho do feixe na parte de trás de um microscópio de fluorescência. Tal como já é descrito na Figura 2 uma cana facilmente implementar dois feixes de excitação, uma em TIRF (indicado em verde) o outro no modo de não-TIRF (indicado na vermelho). Estes tornam-se coberto com a utilização de um divisor de feixe 50:50 (BS). Lentes convexas (L1 e L2) são posicionados nas respectivas vigas para concentrá-los para o plano focal posterior da objectiva (não mostrada). Um periscópio que consiste em dois espelhos (M1 e M2) orienta ambos os feixes através da porta de entrada no microscópio. O primeiro espelho (M1), pode ser movido com o uso de uma fase de tradução (TS) (rodando um parafuso micrométrico como indicado) para mover uma das vigas em posição TIRF. Uma vez que tenha sido estabelecida TIRF, do segundo feixe (utilizado para a foto-branqueamento ou -activation, aqui indicados a vermelho) pode ser ajustada independentemente da viga TIRF para deixar o objectivo de não-TIRFmodo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Figura 6. medição da potência dentro da área central do local de iluminação. Tal como é indicado escolheu regiões apropriadas de interesse, as quais reflectem o fundo, a totalidade da área iluminada (IA) e a zona central (CA), no qual os eventos serão posteriormente gravada. Subtrair os valores de fundo dos registrados para IA e CA e integrar as intensidades multiplicando intensidades médias corrigidas com o número de pixels presentes dentro de cada área (= intensidades integradas). Dividir a intensidade integrada da CA pela de IA para chegar à proporção da potência do feixe de iluminação CA (neste exemplo: 23%). Determinar a potência da luz que ilumina o CA multiplicando a potência do feixe geral (aqui: 5 mW) com a proporção iluminando a CA (aqui: 0,23). Para determinar o tamanho da área central multiplicar a área (aqui: 7089 pixels) com um factor de pixel-a-zona de conversão de tamanho (aqui: 1 / 41,5 uM de 2 pixels -1). Para chegar à densidade de potência média da luz de excitação iluminando o CA, dividir o poder (aqui: 1,15 mW) pelo tamanho da CA. (Aqui: 170,8 mm 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Figura 7. A quantificação de sinais de moléculas individuais. (A) curso Tempo de fluoróforos simples numa SLB. Um pixel de 7 x 7 região tamanho de interesse (ROI, amarelo) é colocada em torno do sinal para a quantificação. O fundo é determinada a partir da um vizinho do pixel de 7 x 7ROI (verde). (B) quantificada intensidades médias de pixel são listados. Para determinar o sinal de molécula individual, os valores de fundo (roi verde) são subtraídos dos valores dos sinais amarelo (ROI) e multiplicado por 49. (C) intensidades das moléculas isoladas de um fluoróforo estão representados graficamente contra o tempo. Note que o ponto de tempo ms 90 é omitido como o fluoróforo está em processo de branqueamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Figura 8. A recuperação de fluorescência após análise Fotodegradação (FRAP) para determinar a integridade do SLB. (A) FRAP foi realizada numa bicamada realização iek / MCC-Alexa Fluor 647. Cada imagem 10a da experiência é mostrado. (B) FRAP quantificação da experiência mostrada em (A). Os valores indicam as intensidades médias (I) dentro da ROI amarelo mostrado em (A), dividido pela intensidade inicial (Io) antes do branqueamento. Pontos de dados são exibidos em vermelho (A), a linha verde indica 0,9 de recuperação de intensidades originais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

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13.8K visualizações.  Vienna University of Technology. Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution. 