The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Limpeza Coverslip NOTA: Trabalhar sob uma coifa. <ol><li> Use uma pinça limpa para colocar lamínulas de vidro (24 mm de diâmetro) em um suporte lamela que separa lamelas individuais. </li><li> Colocar o suporte com lamelas para uma proveta, e adicionar clorofórmio até as lamelas são cobertas. Cobrir a proveta com folha de alumínio para reduzir a evaporação e sonicado num banho de ultra-sons durante 1 hora à temperatura ambiente. Retire o suporte a lamela para fora do copo e deixe as lamelas seco. </li><li> Repetir o passo 1.1.2, com uma solução de NaOH 5M em vez de clorofórmio. </li><li> Retire o suporte da lamela em um novo recipiente e lavar três vezes com água destilada. Coloque lamelas limpas em uma placa de cultura de células de vidro cheio com etanol a 100%. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de calibração <ol><li> Dissolver corante fluorescente no solvente apropriado. </li><li> Prepara-se uma diluição em série 1:10 do corante fluorescente variandoentre 1 pM a 1 nM em filtro esterilizado (0,22 mM) de água. </li><li> Tome lamelas limpas armazenados em etanol a 100% e lava-se com água, esterilizada por filtração. Mancha 20 ul de cada diluição do corante fluorescente em uma lamela limpa separado. Deixe as lamelas secar sob um capuz estéril. Proteja as lamelas da luz e poeira até o uso. Usar estas amostras para avaliar a intensidade de moléculas fluorescentes individuais (ver etapa 3). </li></ol></li><li> A transfecção <ol><li> Cultura de células CHO no meio de uma mistura 1:1 / nutriente de Eagle modificado por Dulbecco F-12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C, em . 5% de CO 2 NOTA: Utilize a mídia livre de fenol-vermelho durante todo o experimento para minimizar autofluorescência. </li><li> Tome lamelas limpos a partir da solução de etanol a 100%, lavá-las com uma solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), e colocar uma lamela em cada poço de uma cultura de células de 6 poços plcomeu. </li><li> Trypsinize, e contar as células CHO semente a uma densidade de 3 x 10 5 células / poço na placa de 6 poços de cultura de células contendo as lamelas. Permitir que as células crescem numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 24 horas, a fim de atingir aprox. 80% de confluência, o que representa a densidade celular óptima para transfecção. </li><li> Para cada poço, diluída de 2 ug de ADN de plasmídeo desejado (por exemplo., SNAP-tag β receptor 2-adrenérgico) e 6 uL de Lipofectamine 2000, em dois tubos separados contendo 500 ul de meio de Optimem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Combina-se as soluções a partir do passo 1.3.4 em um tubo e misturar para obter uma mistura de transfecção. Incubar a mistura de transfecção em TA durante 20 min. </li><li> Durante a incubação (1.3.5), levar as células CHO e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml / poço de meio de vermelho de fenol livre de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, mas sem antibióticos. </li><li> Adicionar toda a transfecçãomistura de iões (1 ml) a partir do passo 1.3.5, gota a gota a cada poço, e abane a placa para trás e para assegurar a mistura completa. </li><li> Incubar durante 2 a 4 horas a 37 ° C, em 5% de CO 2 e proceder imediatamente a seguir para o passo seguinte NOTA:. Estas condições de transfecção foram optimizados para conseguir densidades de receptores &lt;0,45 partícula / iM de 2, que são adequadas para uma única imagiologia molécula. Ajustes podem ser necessários quando se utiliza diferentes células, construções ou reagentes. </li></ol></li><li> De marcação de proteínas <ol><li> Dilui-se 1 ml de solução de estoque fluoróforo-BG em 1 ml de meio de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10% para obter uma concentração final de 1 uM. Levar as células transfectadas da incubadora e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml de solução de fluoróforo 1 uM-BG e incubar durante 20 min a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador. </li><li> Após a incubação, lavar as células trêsvezes com meio DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, de cada vez seguido de 5 minutos de incubação a 37 ° C. Dê uma lamela (com células marcadas) com uma pinça e colocá-lo em uma câmara de imagem. </li><li> Lavar duas vezes com 300 ul de tampão de imagem. Adicionar 300 mL de tampão de imagem fresca e proceder de imediato à imagem (parte 2). </li></ol></li></ol> 2. Aquisição de Imagem NOTA: Use uma reflexão interna total de fluorescência (TIRF) microscópio, equipado com um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (por exemplo, 100X magnification/1.46 abertura numérica.), Lasers adequados (por exemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 645 lasers de diodo nm), um elétron multiplicação Charge Coupled Device (EMCCD) câmera, uma incubadora e um controle de temperatura para visualizar moléculas fluorescentes individuais. <ol><li> Defina os parâmetros desejados, ou seja, de microscópio., Linha laser, ângulo TIRF (este parâmetro controla a penetraçãoprofundidade ção do campo evanescente), tempo de exposição, taxa de quadros e número de imagens por filme 10. Mantenha o controle do aquecedor / incubadora e temperatura sempre para evitar desvios de temperatura e condensação de umidade. </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo 100X do microscópio. Coloque a câmara de imagens com as células marcadas para o suporte da amostra do microscópio, e trazer as células em foco com uma iluminação de campo claro. </li><li> Mudar para iluminação TIRF. Mantenha a potência do laser tão baixo quanto possível para permitir a pesquisa para a célula desejada, mas, ao mesmo tempo que minimiza o fotobranqueamento. </li><li> Selecione a célula desejada e multa ajustar o foco. Defina a potência do laser para um nível que permite a visualização de fluoróforos individuais. Adquirir seqüência de imagens e salvar o arquivo de seqüência de imagens raw como. Tiff. </li></ol> 3. Calibration (fluoróforos individuais sobre vidro e monoméricas / Controles Receptores diméricas) <ol><li> Monte cada sampl calibraçãoe preparados como descrito em 1.2, no câmara de imagem. Colocar cada amostra ao microscópio e escolher a amostra contendo manchas limitada de difração bem separados que lixívia em uma única etapa NOTA:. Estes pontos representam moléculas de corante fluorescente. </li><li> Adquirir sequências de imagens TIRF como descrito no passo 2 Importante:. Os mesmos parâmetros de formação de imagens devem ser usadas em todas as experiências, incluindo aqueles para a calibração. </li><li> Realizar a detecção e acompanhamento de análise conforme detalhado na 4,1-4,2. Extrai-se a intensidade de cada uma das partículas como descrito em 4.2.6. A partir destes dados, calcular a média (μ) e desvio padrão (σ) da intensidade de fluoróforos individuais. </li><li> Opcional: executar a mesma análise sobre as células transfectadas com um receptor de superfície celular monomérica (. Por exemplo, CD86), N-terminal etiquetado com uma ou duas cópias de SNAP 10 e marcado com o fluoróforo derivado-BG. Follow o procedimento acima descrito para o fluoróforo único em vidro. Estimativa da eficiência de marcação, tal como descrito em Calebiro, D. et al. 10 </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Preparação seqüência de imagens <ol><li> Utilize um software de processamento de imagem (por exemplo., ImageJ) para cortar as imagens. </li><li> Salve quadros individuais como separado. Imagens TIFF em uma nova pasta, indicando em cada imagem o número do quadro. </li><li> Medir a área de superfície da célula através da elaboração de uma região de interesse (ROI) ao longo do contorno de uma célula e utilizando a ferramenta da medida em ImageJ ou um instrumento semelhante, em outro software. Utilizar este valor para calcular a densidade da partícula, dividindo o número total de partículas no início do filme pela área da superfície da célula. </li></ol></li><li> Detecção e rastreamento de partículas NOTA: Use um software não comercial, como u-track 13, trabalhando em Matlabmeio ambiente, para detectar e rastrear partículas receptores individuais automaticamente. NOTA: O algoritmo de u-pista é baseado no método de rastreamento de várias hipóteses. Esta abordagem liga partículas entre quadros por construir matrizes de custo, onde as probabilidades, que uma dada partícula em um quadro corresponde a uma dada partícula do próximo quadro, aparece, desaparece ou funde / divide com / a partir de outras partículas são atribuídos. A solução que minimize os custos a nível global, ie., Aquele com a maior probabilidade, é finalmente selecionado. Isso também permite o acompanhamento de um partícula desaparecer temporariamente, um fenômeno típico causado pelo fluoróforo piscar. A última versão do u-track (2.1.0) tem interfaces gráficas que facilitam a execução dessas análises. <ol><li> No prompt de comando do Matlab, digite &quot;movieSelectorGUI&quot; para abrir a interface de seleção de filmes. Siga as instruções para criar umanovo banco de dados filme a partir das imagens separadas salvas anteriormente (ver 4.1.2). </li><li> Fornecer o tamanho do pixel em nm, intervalo de tempo em segundos, abertura numérica, profundidade de bits da câmara e comprimento de onda de emissão do fluoróforo, necessário para a detecção e monitoramento de partículas. Salve o banco de dados do filme. </li><li> A partir da interface de seleção de filmes, executar a análise, a escolha de &quot;partículas individuais&quot; como o tipo de objetos. Uma nova janela aparecerá onde os parâmetros utilizados para detecção e rastreamento de partículas pode ser definido. Comece com os parâmetros padrão. Mais tarde, ajustar esses parâmetros, se a qualidade da detecção e / ou rastreamento não é satisfatório (por exemplo, algumas partículas não são detectados ou faixas são fragmentados) Opcional:. Sob as configurações de rastreamento, marque &quot;resultados de rastreamento Exportar para o formato matriz&quot; para armazenar as coordenadas e as amplitudes de todas as partículas em uma única matriz (campo denominado &quot;trackedFeaturedInfo&quot;). Para uma descrição detalhada destes parâmetros, consulte a documentação do u-track. </li><li> Execute o algoritmo de detecção. Este algoritmo determina automaticamente a localização ea intensidade acima do fundo de cada ponto de difração limitada (ou seja., Complexos de receptores individuais / receptores) por montagem de uma função gaussiana bidimensional com desvio padrão igual à função de ponto de difusão do microscópio em torno maxima intensidade local . Em seguida, execute o algoritmo de rastreamento. Armazenar os resultados das análises de um arquivo de esteira.. </li><li> Use a rotina &quot;movieViewer&quot;, contido no pacote u-track, ou os personalizados semelhantes a visualizar as pistas e verificar a qualidade de detecção e rastreamento. </li><li> Abra o ficheiro de esteira. Ver a posição e amplitude (isto é., Intensidade) das partículas controladas em cada trama. Os dados gerados no passo 4.2.4 estão contidas no domínio tracksCoordAmpCG do ar tracksFinalray e / ou em trackedFeaturedInfo. A partir do número total de partículas detectada calcular a densidade das partículas dividindo este valor pela área da superfície da célula medida em 4.1.3. </li><li> Opcional: Utilize a partícula coordena ao longo do tempo (ver 4.2.6) para analisar o movimento das partículas de receptores. Calcular os deslocamentos médios quadrados (MSD) e coeficientes de difusão (D), utilizando Matlab ou software similar. Para cada partícula e de cada intervalo de tempo (Δ t) considerado, calcular o deslocamento médio quadrático (MSD) utilizando a seguinte fórmula: <img align="middle" alt="Equação 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> onde Δ t é o intervalo de tempo em quadros, N é o número de etapas analisadas, x e y são x e y da partícula coordenadas no quadro indicado pelo índice. Use o MSD sobre parcelas de tempo para avaliar o tipo de movimento de uma dada partícula: relações linearesindicam uma difusão livre (isto é., movimento browniano), uma curvatura positiva (isto é., a curva se parece com uma parábola) sugere movimento dirigido, uma curvatura negativa é um indicativo de movimento confinado 14. No caso de partículas que difundem livremente, calcular o coeficiente de difusão (D) de cada partícula de pelo ajuste dos dados MSD obtidos com a seguinte equação: <img align="middle" alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Cálculo de tamanho de partícula com o método de montagem de Gauss Observação: Uma vez que a distribuição de intensidade de amostras de calibração (fluoróforos individuais em vidro e / ou os receptores monoméricos marcados com fluorescência) é conhecida, realizar um ajuste de Gauss misto sobre a distribuição das intensidades de partículas no início de uma sequência de imagens para determinar o tamanho dos complexos de receptores (isto é., o número de receptores por partículas) 10. Execute estas análises utilizando Matlab ou ssoftware imilar. <ol><li> Calcula-se a intensidade de cada partícula a média da intensidade da partícula do primeiro quadro para o quadro antes da primeira mudança na intensidade ocorreu (na maioria dos casos uma diminuição devido à fotodegradação). </li><li> Realizar um encaixe Gaussian misto de acordo com a seguinte equação: <img align="middle" alt="Equação 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> onde φ (i) é a frequência de partículas tendo intensidade i, n é o número de componentes, α n é um parâmetro que contribui para a altura do componente de n, e μ σ são a média e o desvio padrão da intensidade de referência fluoróforos individuais . (calculada tal como descrito no passo 3) NOTA: Determinar tele número máximo de componentes (n max) para cada seqüência de imagens, aumentando progressivamente até o máximo n adição de um componente que já não produzem um melhor encaixe estatisticamente, como julgado por um teste F. </li><li> Opcional: (., Por exemplo, nos últimos 60 quadros de uma seqüência de quadros 400) Execute um ajuste de Gauss misto na distribuição de intensidade obtidos nos últimos quadros do filme. Substitua μ e σ com os valores obtidos após este ajuste, que fornecem estimativas refinados para esses parâmetros, e repita o passo 4.3.2. </li><li> Calcula-se a área sob a curva (AUC) de cada um dos componentes do encaixe Gaussian misto. Calcular a abundância relativa de partículas de receptores de diferentes tamanhos (isto é, monómero, dímero, trímero, etc), dividindo o valor de AUC de cada componente pela AUC de toda a distribuição. </li><li>Opcional: usar dados de diferentes células e as densidades de partículas correspondentes (calculados como descrito no ponto 4.2.6) para gerar parcelas onde a distribuição de partículas com tamanho diferente está correlacionada com a densidade de partículas 10. </li></ol></li><li> Cálculo de tamanho de partícula com o método de passo a montagem NOTA: Usar uma análise de ajuste passo como um método alternativo para determinar o tamanho dos complexos de receptores 10. A base para esta análise é o de que a destruição induzida pela luz (fotodegradação) de uma única resultados fluoróforo no seu desaparecimento instantâneo - assim partículas contendo fluoróforos n se espera que a produção de lixívia, progressivamente um perfil de intensidade com o n passos. <ol><li> Extrato de perfis de intensidade de cada partícula do arquivo mat. Gerado por u-track ou software de detecção / rastreamento semelhante (ver 4.2.6). </li><li> Usar um algoritmo de ajuste de fase, tal como o apresentadona ref. 10, para contar o número de passos de branqueamento para cada partícula. </li><li> Opcional: utilizar os resultados para gerar distribuições mostrando a abundância relativa de partículas de tamanho diferente do receptor e correlacioná-los com uma densidade de partícula tal como anteriormente descrito para os resultados da instalação de Gauss misto (ver 4.3). </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

O protocolo descrito permite a análise do arranjo espacial, a mobilidade e o tamanho dos complexos de receptores da superfície celular no nível de molécula única. Em comparação com a utilização de proteínas fluorescentes, marcação com fluoróforos orgânicas pequenas, que são mais claras e mais fotoestável, tem a vantagem de permitir a visualização ampliada das partículas de receptores individuais. Uma vez que os níveis extremamente baixos de expressão são atingidos (&lt;0,45 mM partículas do recept...

Receptores localizados na superfície da célula sentir do ambiente extracelular e responder a uma variedade de estímulos, tais como aromatizantes, iões, pequenos neurotransmissores e hormonas proteicas grandes. A natureza fluida das membranas celulares permite movimentos de receptores e outras proteínas de membrana. Isto é essencial para a formação de complexos de proteínas e a ocorrência de interacções proteína-proteína transitórios, tais como os utilizados pelos receptores para montar em unidades funcionais e transdução de sinais no interior das células. Por exemplo, L-receptores acoplados à proteína (GPCRs), que constituem a maior família de receptores da superfície celular, um, têm sido sugeridos para formar di-/oligomers, que parece estar envolvida na regulação de ajuste entre a transdução de sinal e pode ter conseqüências fisiológicas e farmacológicas importantes 2-5. Microscopia única molécula tem o grande potencial de visualizar diretamente com alta spatiotempresolução por via oral o comportamento dinâmico de receptores individuais localizados na superfície de células vivas, incluindo a sua associação para formar dímeros e complexos moleculares de maior ordem de 6-10. Este oferece várias vantagens em relação aos métodos bioquímicos e de microscopia de padrão, que geralmente relatam o comportamento médio de milhares ou milhões de moléculas. De marcação de proteínas com um fluoróforo suficientemente brilhante e fotoestável é essencial para a microscopia de molécula única. Este protocolo tem vantagem de a marca de SNAP recentemente introduzido 11 para ligar covalentemente as pequenas e brilhantes fluoróforos orgânicos para os receptores da superfície celular. SNAP é uma proteína de 20 kD marcação derivados a partir da reparação do ADN enzima O-DNA alquiltransferase 6-alquilguanina humano, que pode ser irreversivelmente marcado com fluoróforo conjugado benzilguanina (fluoróforo-BG) derivados. CLIP, uma marca ainda mais engenharia derivada da SNAP, pode ser em vez marcado com fluoróforo-cderivados benzilcitosina onjugated 12. O protocolo relatado neste manuscrito explica como a transfectar e etiqueta SNAP-11 com etiquetas receptores com pequenos fluoróforos orgânicos e utilizar de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar os receptores individuais ou complexos de receptores na superfície de células vivas 10. Os resultados do protocolo relatado em&gt; 90% de eficiência de marcação de uma extracelularmente SNAP-tag de proteína da superfície da célula 10. Para mais informações sobre a utilização de dados de molécula única para analisar o tamanho e a mobilidade dos complexos de receptores, bem como para capturar as interacções receptor-receptor transiente, é fornecida. Um fluxo esquemática de todo o protocolo é dada na Figura 1. Como um exemplo, a transfecção de células de ovário de hamster chinês (CHO) com L-receptores acoplados à proteína SNAP-tag (GPCRs) seguido de marcação com um derivado de fluoróforo-BG quanto bem como a sua aplicação a quantify e di-/oligomerization receptor do monitor são descritos. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas da superfície celular, e marcadores fluorescentes (p. ex., CLIP), assim como a outros métodos de transfecção e de rotulagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

Microscopia única molécula está emergindo como uma abordagem poderosa para analisar o comportamento de moléculas de sinalização, nomeadamente sobre os aspectos (por exemplo., Cinética, a coexistência de diferentes estados e populações, interações transitórias), que são normalmente escondidos em medições Ensemble, como os obtidos com métodos bioquímicos ou microscopia padrão. Assim, os eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor, pode ser acompanhado em tempo real em uma célula viva com alta resolução espaço-temporal. Este protocolo descreve um método baseado na marcação com fluoróforos orgânicas pequenas e brilhantes e de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar directamente os receptores individuais sobre a superfície de células vivas. Esta abordagem permite localizar com precisão os receptores, medir o tamanho de complexos receptores, e capturar eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor transitórias. O protocolo proporciona uma descrição detalhada de como perform uma experiência única molécula, incluindo a preparação de amostras, aquisição de imagem e análise de imagem. Como um exemplo, a aplicação do presente método para analisar acoplados à proteína G, com dois receptores, ou seja., Β 2-adrenérgicos e γ-aminobutírico tipo ácido B (GABA B) do receptor, é relatado. O protocolo pode ser adaptado para outras proteínas da membrana de células e modelos diferentes, os métodos de transfecção e estratégias de rotulagem.

O protocolo descrito pode ser aplicado a uma variedade de diferentes proteínas de membrana. Como um exemplo, os resultados representativos obtidos com β receptores 2-adrenérgicos e receptores GABAB são relatados 10. Desde sinais fluorescentes de moléculas individuais são fracas, a minimização da fluorescência de fundo é o primeiro passo fundamental para resultados bem sucedidos. Assim, é importante o uso de lamelas extensiva limpeza (Figura 2A), bem como para ...

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High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K visualizações.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

Vídeo: High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bioengenharia

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...