Este protocolo permite gerar um grande número de células T específicas de antígeno funcional que são uma abordagem segura desejada no tratamento de doenças autoimunes. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um processo de transdução altamente eficiente e um grande número de células T funcionais. Esta técnica pode ser estendida para tratar diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes nas quais os antígenos são conhecidos.
Além disso, as células CAR T podem ser um tratamento promissor para certos tipos de câncer. Este método pode ser usado para gerar células imunes expressando outros CARs. É importante ter uma técnica bem aceita, ler todo o protocolo e planejar todo o experimento com antecedência.
Este protocolo de duas semanas inclui mini-passos e o sucesso depende do desempenho adequado de cada etapa. Demonstrações visuais deste método são fundamentais para que os alunos sigam corretamente. Prepare as células de Phoenix para transfecção, como descrito no manuscrito.
É uma boa prática marcar a parede lateral onde o meio será adicionado e removido para minimizar o desmendo as células. No dia zero aspirar o supernaente das células e lavá-los com cinco mililitros de PBS. Adicione cuidadosamente sete mililitros de soro reduzido médio dropwise à parede lateral da placa e transfira as células de volta para a incubadora.
Adicione 1,5 mililitros de meio de soro reduzido a dois tubos de polipropileno de fundo redondo de 14 milímetros. Adicione 40 micrômetros de reagente de transfecção a um dos tubos e 15 microgramas de plasmídeo CAR redirecionado de anticorpos, juntamente com cinco microgramas de plasmídeo de embalagem para o outro. Incubar os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicionar reagente de transfecção ao tubo plasmídeo.
Misture gentilmente a solução três vezes e incuba-a à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Adicione três mililitros da mistura às células de Phoenix e coloque-as em uma incubadora de cultura tecidual. Depois de quatro a cinco horas adicione um mililitro de FCS às células e cultue-as durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, remova o supernasce das células e adicione quatro mililitros de meio de cultura pré-armada fresco. Colher o vírus no segundo dia coletando o vírus contendo meio das células de Phoenix e filtrando-o para remover detritos de células residuais. Adicione estoque de IL-2 humano recombinante ao vírus para uma concentração final de 200 unidades internacionais por mililitro e use-o imediatamente para transdução.
Adicione quatro mililitros de meio fresco às células de Phoenix e coloque-os na incubadora durante a noite. Repita a coleta de vírus no dia seguinte para uma segunda transdução e descarte as células. Um dia antes de semear células murine CD8 T, adicione um mililitro de uma mistura de anticorpos anti-mouse CD3 e CD28 a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia zero, colhe o baço do rato e coloca-os em um coador de células imersos em 10 mililitros de PBS em um prato de cultura celular no gelo. Em uma capa de cultura celular, corte cada baço em três a cinco pedaços e use um êmbolo estéril de uma seringa para pressionar o tecido através da malha de arame. Remova suavemente os glóbulos vermelhos reutilizando esplenócitos em um a quatro tampão de lise de células vermelhas diluídas e incubando-os à temperatura ambiente por cinco minutos e depois dilua 10 microliters da suspensão celular com Trypan Blue para contagem celular.
E pelota o resto das células por centrifugação a 350 vezes g por sete minutos. Use um kit de isolamento celular CD8 T para enriquecer as células CD8 T e suspender as pelotas de células em 400 microliters de buffer com 100 microliters de coquetel de anticorpos biotina por uma vez 10 a oitava células. Misture bem a suspensão celular e incuba-a por cinco minutos a quatro graus Celsius para permitir a ligação de anticorpos.
Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de rotulagem e 200 microliters de MicroEsferas Anti-Biotina por uma vez 10 às oitavas células. Misture bem e incubar por mais 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, configure uma coluna de separação no separador e lave-a com três mililitros de tampão de rotulagem.
Coloque um coador de células de 40 micrômetros na parte superior de uma coluna e passe um mililitro da mistura de contas e células através do coador na coluna de separação. Colete o fluxo através de um tubo pré-15 mililitro e lave a coluna de acordo com as instruções do fabricante, coletando efluentes no mesmo tubo. Conte as células e colete-as por centrifugação a 350 vezes g por cinco minutos.
Lave-os com dois mililitros de células T média e centrífuga novamente. Em seguida, resuspensá-los em meio de células T pré-armados em uma concentração de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave as placas revestidas de anticorpos CD3 e CD28 previamente preparadas com um mililitro de PBS estéril três vezes e adicione dois mililitros da suspensão celular a cada poço.
Use um movimento de redemoinho para dispensar as células uniformemente. Como controle, plaque o mesmo número de células CD8 T em um único poço não revestido da placa e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de tanques de gás de 10% de dióxido de carbono por 48 horas. No primeiro dia, prepare as placas revestidas de fragmento de fibronectina humana adicionando 0,5 mililitros de fibronectina aos poços de uma placa de 24 poços e incubando-a durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, remova a solução de fibronectina e adicione um mililitro de 2%BSA e PBS por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos e lavar os poços tratados com um mililitro de PBS estéril. A placa está pronta para uso após a remoção da solução de lavagem.
Conte as células CD8 T ativadas usando Trypan Blue. Colecioná-los por centrifugação. E resuspensá-los em cinco milhões de células viáveis por mililitro para transdução.
Adicione 100 microliters da suspensão celular CD8 ativada a cada poço da placa revestida de fibronectina. Em seguida, adicione 1,5 a dois mililitros do vírus previamente preparado contendo meio e misture usando um movimento de redemoinho para dispensar uniformemente as células. Sele a placa em um saco Ziploc e centrifuá-la a 2.000 vezes g por 90 minutos a 37 graus Celsius.
Remova a placa da centrífuga e leve-a para um armário de segurança biológica. Retire cuidadosamente o saco plástico e certifique-se de que a parte externa da placa não esteja contaminada com meio. Transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius.
Após quatro horas, remova um mililitro de meio de cada poço, substitua-o por um mililitro de meio de célula T completo pré-armado e coloque a placa de volta na incubadora. Os aspectos críticos deste protocolo são um vírus de alta titulação, células T ativadas saudáveis e o método de transdução apropriado. As células foram co-manchadas com pe tamanho sete anti-CD8 conjugado, AF647 conjugado anti-CD3, e BV 421 conjugado anti-CD28 para análise citométrica de fluxo.
Aproximadamente, 70% das células CD8 T co-expressas GFP que indica expressão CAR. Eles também co-expressaram CD28 e CD3. É importante ressaltar que todas as células positivas do teste GFP também co-mancham com tetramers de insulina I-Ag7 BR3 que indica expressão de CAR na superfície celular, mas não com o tetramer de controle.
Além disso, as células CAR T classificadas de teste e controle se secretaram altos níveis de gama interferon somente após a cocultura com células-alvo expressando seus ligantes cognatos que confirmam que as células transduzidas têm um fenótipo de células T efeito CD8 direcionados para o alvo dos anticorpos-pais. A transdução de células produtoras de vírus, o isolamento das células T primárias cd8 e a ativação dessas células T são os passos mais importantes deste experimento. Ter células T ativadas saudáveis e transdução dessas células T com reagentes apropriados garante resultados favoráveis.
Este método pode ser usado para transdutar outras células T, mas deve ser personalizado para o tipo específico de célula T. Este protocolo abre caminho para a prevenção do diabetes tipo 1 com terapia celular receptor de antígeno t específica de antígeno.
