Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunologia, como como os glóbulos brancos são ativados e como as alergias a alérgenos individuais se desenvolvem? A principal vantagem deste modelo robusto e reprodutível de camundongos alérgicos é que menos camundongos podem ser usados para produzir uma menor variância com uma população experimental. Novas imunoterapias para controlar respostas imunes requerem modelos robustos de camundongos como um meio inicial de testar a eficácia in vivo.
Assim, as implicações dessa técnica se estendem para a imunoterapia alérgica. Embora este método possa fornecer insights sobre alergias, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a autoimunidade em que respostas de anticorpos indesejados desempenham um papel fundamental na doença. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão por falta de experiência em trabalhar com nanopartículas liposômicas ou uma inexperiência com as técnicas exigidas no trabalho do camundongo.
Comece adicionando 2,5 molares equivalentes ao crosslinker heterobifuncional à proteína e colocando a reação em um agitador oscilante à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora. Após uma incubação de uma hora com SPDP, desáde a proteína em uma coluna equilibrada em acetato de sódio de 100 milimólares, e colete as frações. Determine a absorvância de 280 nanômetros e acumule as frações superiores.
Lave a coluna em PBS e adicione dithiothiothreitol de 25 milimolares, ou DTT, às frações de proteína agrupadas para uma incubação de cinco a dez minutos. Em seguida, meça as absorvâncias de 280 e 343 nanômetros da proteína para permitir o cálculo da razão de ligação com base na molaridade da proteína e do linker. Em seguida, execute as frações agrupadas da coluna lavada pbs, e colete as frações para medição do pooling de 280 nanômetros e frações superiores, como demonstrado.
Adicione o volume apropriado de 100x DSPE-PEG2000-Maleimide à proteína para alcançar uma concentração final de excesso de molar de 1x e 10 vezes com redemoinho suave. Então, execute a reação durante a noite sob nitrogênio em um frasco de fundo redondo selado. No dia seguinte, execute a proteína sobre uma coluna de contas de gel dextran cruzada, e armazene as frações finais de proteína ligadas a lipídios a quatro graus Celsius até seu uso.
Uma vez calculada a quantidade correta de cada lipídio, combine todos os lipídios em um tubo de teste de vidro borossilicato de 12 mililitros, e use uma seringa de três mililitros e tubos para soprar cuidadosamente o clorofórmio com nitrogênio. Em seguida, lyophilize a solução com 100 microliters de DMSO durante a noite. Na manhã seguinte, adicione um mililitro de proteína ligada a lipídios ao tubo lipídico de 12 mililitros, e sonicar a solução três a quatro vezes por 30 a 60 segundos por sonicação em um banho de água de sônica com pelo menos cinco minutos de descanso entre sônicas.
Após a última sônicação, carregue a amostra em uma das seringas extrudantes colocadas na extrusora, e coloque a seringa extrusora na outra extremidade da extrusora. A seringa vazia se encherá à medida que o lipídio é extrudado através da membrana de 0,8 micrômetros de policarbonato. Coloque a extrusora totalmente montada em um bloco de aquecimento e pressione suavemente o êmbolo para esvaziar a seringa.
Após a última extrusão, transfira os lipossóis para um frasco limpo, e extrude os lipídios através de membranas de policarbonato 0,2 e 0,1 micrômetros como apenas demonstrado. Em seguida, armazene os lipossomos a quatro graus Celsius. Para monitorar a resposta das células B à ativação lipossoma antigênica, resuspensar 1,5 vezes 10 para o sétimo esplenócito no tampão de carregamento de fluxo de cálcio, e adicionar 1,5-micromolar Indo-1 às células, invertendo a solução no tubo várias vezes para misturar.
Após uma incubação de banho de água de 30 minutos a 37 graus Celsius, protegido da luz, adicione cinco vezes o volume de tampão de carregamento de fluxo de cálcio e centrifugar as células rotuladas pelo Indo-1. Para gating de células B, células de coloração com anticorpo anti-CD5 e anti-B220 em 0,5 mililitros de tampão de carga a quatro graus Celsius por 20 minutos, protegidas da luz. No final da incubação, lave as células em tampão de carregamento de fluxo de cálcio fresco e resuspenja a pelota de uma a duas vezes 10 para a sétima célula por mililitro de fluxo de cálcio fresco que executa buffer para armazenamento no gelo, protegido da luz até a análise.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de células a um capped, cinco mililitros, fundo redondo, tubo de poliestireno, e aqueça as células a 37 graus Celsius em um banho de água. Depois de três a cinco minutos, transfira o tubo para uma câmara reveste de água Celsius de 37 graus conectada a um banho de água recirculante, e execute o tubo na capa de água no citómetro de fluxo. Depois de coletar de 5.000 a 10.000 eventos por segundo, permita que as células se estabilizem por 15 a 30 segundos e reiniciem a aquisição de dados, coletando os dados por pelo menos 10 segundos para estabelecer uma leitura de fundo.
Na marca de 10 segundos, remova rapidamente o tubo do citômetro de fluxo, e adicione a concentração experimental apropriada de lipossomos antigênicos. Em seguida, pulso vórtice das células, e leia o tubo no cítmetro por mais três a cinco minutos. Para sensibilizar os animais, entregue 200 microliters de extrato de amendoim contendo toxina de cólera através de gavage oral para cada receptor de camundongos BALB/c de quatro a cinco semanas de idade uma vez por semana durante três semanas e 300 microlitres de extrato de amendoim diluído na quarta semana.
No dia 28, prepare o extrato de amendoim para uma concentração final de um miligrama por mililitro na PBS, e use um termômetro retal para medir a temperatura corporal da linha de base de cada animal sensibilizado. Quando todas as temperaturas tiverem sido medidas, administre 200 microliters de extrato de amendoim a cada receptor via injeção intraperitoneal, e meça a temperatura corporal com o termômetro retal a cada 15 minutos durante uma hora após a injeção. Um mergulho na temperatura corporal indica uma alergia ao amendoim.
Depois de isolar esplenócitos dos camundongos alérgicos a amendoim, use uma seringa de insulina de um mililitro equipada com uma agulha de 27 bitolas e 5/8 polegadas para injetar intravenosamente 1,5 vezes 10 a 10 para o sétimo dos esplenócitos alérgicos extraídos nas veias da cauda de animais ingênuos e não consagrados. Um dia após a transferência adotiva, injete por via intravenosa 200 microliters de lipossomos antigênicos Ara h 2 na veia traseira de cada rato BALB/c que recebeu os esplenócitos alérgicos. Duas semanas após a injeção de lipossomo, aumente os ratos com um i.p.
injeção de solúvel Ara h 2, seguido por um desafio Ara h 2 de 200 microliter no dia 61. Em seguida, meça as temperaturas do corpo com a sonda retal a cada 15 minutos, como demonstrado. A conjugação proteica pode ser demonstrada executando um gel redutor mostrando um aumento no peso molecular em comparação com a proteína não conjugada.
Para avaliar o fluxo de cálcio de células B estimulados por liposomos antigênicos, portal as células individuais vivas para permitir a seleção das células B-positivas de CD5-negativos B. A razão de flaviolência violeta Indo-1 versus Indo-1 ao longo do tempo pode então ser analisada para avaliar a quantidade de ativação de células B induzidas por lipososom. A quantificação de IgE e IgG1 específicos de Ara h 2 no soro de camundongos com extrato de amendoim sensibilizados pela ELISA indica que camundongos com sensibilidade conferida que são impulsionados com Ara h 2 exibem IgE e IgG1 específicos de Ara h 2 em seu soro.
As temperaturas do corpo registradas durante o desafio Ara h 2 revelam que camundongos alérgicos demonstram temperaturas corporais reduzidas após o desafio, enquanto as temperaturas corporais em camundongos ingênuos permanecem consistentes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de acompanhar cuidadosamente a quantidade de proteína ligada a lipídios que está sendo incorporada aos lipossomos, pois muita proteína pode dificultar a extrusão. Após esse procedimento, outros métodos como o rastreamento e a triagem de células B e T específicas para alergênicos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como essas células específicas de alérgenos respondem às terapias.
Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores do campo de alergia explorarem novas imunoterapias que combatem doenças alérgicas usando este modelo de camundongo. Não se esqueça que trabalhar com toxina de cólera pode ser perigoso e que as diretrizes para seu uso devem ser seguidas de acordo com suas normas locais de segurança biológica institucional.
