A co-imunoprecipitação multiplexada quantitativa, ou QMI, permite que os usuários meçam simultaneamente centenas de interações binárias em uma rede de interação proteica predefinida. Ao realizar vários co-IPs simultaneamente no mesmo lysate, as técnicas de bioinformática podem então examinar como grupos de co-associações mudam de forma coordenada. O ensaio é demorado para se desenvolver, mas uma vez que o painel QMI está na mão, os dados da escala de rede podem ser coletados sobre sistemas de transdução de sinal em um ensaio relativamente simples durante a noite.
QMI requer a pipetação precisa de diferentes amostras e reagentes em 96 placas de poço. Notas cuidadosas devem ser tomadas ao configurar e executar cada ensaio para evitar erros. Para preparação da amostra e imunoprecipitação, comece por lise a amostra em um detergente adequado com inibidores de protease e fosfatase para uma incubação de 15 minutos no gelo.
No final da incubação, gire a amostra para remover as membranas e detritos e realize um ensaio de BCA sobre o sobrenante para determinar a concentração de proteínas de acordo com os protocolos padrão. Depois de normalizar as concentrações proteicas, prepare uma mistura magnética de mestre de contas que contém aproximadamente 250 contas magnéticas de cada classe por poço. Use a separação magnética para lavar a mistura de contas magnéticas duas vezes no buffer Fly P antes de reutilizar as contas em 20 microliters de buffer Fly P por amostra.
Após uma pipetação completa, alíquota de 20 microlitadores de contas em um tubo de microcentrifuuge gelado por amostra e adicione volumes iguais de lisato com concentrações proteicas normalizadas em cada tubo para imunoprecipitação. Em seguida, divida cada amostra de lise em um tubo para cada placa que está sendo executada e imunoprecipita as amostras em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite protegido da luz. Na manhã seguinte, use um rack de contas magnética para remover o lise do primeiro conjunto de tubos e lavar as contas duas vezes em 500 microliters de tampão Fly P frio por lavagem.
Após calcular o volume de resuspensão, resuspense os imunoprecipitatos no volume calculado de tampão Fly P gelado. Resuspenque minuciosamente as contas magnéticas por tubulação suave e distribua 25 microliters de contas por poço através de uma placa de poço de fundo plano 96 no gelo. Em uma placa de poço diferente de 96, diluído por anticorpos da sonda attinilated para uma concentração de trabalho duas vezes.
Use uma pipeta multicanal para distribuir 25 microlitadores de cada diluição de anticorpos da sonda nos poços apropriados da placa magnética contendo placa de ensaio e agite em alta velocidade em um agitador de placa horizontal para misturar e resuspensar as contas magnéticas. Após a mistura, reduza a velocidade para uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius protegido da luz. No final da incubação, lave a placa três vezes com tampão Fly P fresco por lavagem em uma arruela de placa magnética a quatro graus Celsius.
Após a última lavagem, resuspenja as contas em 50 microliters de streptavidin PE diluído de um a 200 em buffer Fly P. Agite a mistura e resuspenque as contas antes de incubar a placa a quatro graus Celsius por 30 minutos protegido da luz. No final da incubação, lave a placa três vezes com tampão Fly P em uma arruela de placa magnética a quatro graus Celsius e resuspenque as contas em 125 microliters de buffer Fly P.
Agite a placa por um minuto em 900 rotações para resuspensar completamente as contas e carregar a placa em um citômetro de fluxo reautor. No software do citómetro de fluxo, selecione a configuração high RP1 Target, uma condição de parada de 1.000 contas por região e um volume amostral de 80 microliters. Pausa a corrida no meio do caminho e resuspense as contas para evitar a acomodação.
No final da execução, exporte os arquivos de dados no formato XML. Para realizar a análise do ANC, preencha o arquivo de entrada ANC para refletir os detalhes do projeto experimental e execute o programa, que escreverá um arquivo CSV no diretório ativo. O arquivo terminando em hits.
CSV relatará as associações proteicas significativamente diferentes a um nível falso positivo de 0,05 entre o controle e as condições experimentais em pelo menos três das quatro réplicas experimentais. Para análise ponderada da rede de correlação, cole os títulos da coluna da saída do arquivo de dados pela Matlab terminando em mfi. csv na primeira coluna de uma nova planilha e adicione as colunas Experimento para número de experimento e tratamento para tratamento experimental e quaisquer outras variáveis a serem analisadas.
Salve este arquivo como características. csv e open R Studio. Defina o diretório de trabalho para uma pasta contendo o mfi.
csv e traços. arquivos csv, seções de destaque de código e hit Command Enter para executar os comandos R como indicado no arquivo de Comando comentado. Os módulos de análise de rede de correlação ponderada significativamente correlacionados com cada traço experimental serão produzidos como um arquivo gráfico e a correlação de cada interação com cada módulo será saída como um arquivo CSV.
Para cada interação no arquivo de saída ANC, identifique se essa interação também é significativa pelo CNA e crie uma nova coluna que indique se cada hit anc também é um hit CNA. Converta os valores para registrar duas alterações de dobra e calcule o valor médio de todos os acessos cna sindical da ANC. Finalmente, faça uma nova planilha com cada hit cna da união ANC listado por seu alvo de imunoprecipitação em uma coluna, seu alvo de sonda na segunda coluna e seu valor de alteração de dobra na terceira coluna.
Importe este arquivo para Cytoscape como uma rede para criar um diagrama de borda de nó. As interações proteicas de alta confiança identificadas pelas duas abordagens estatísticas independentes são visualizadas como diagramas de borda de nó usando o software de código aberto, Cytoscape, ou como mapas de calor usando o código R e instruções de análise incluídas no material suplementar. Ao longo do protocolo, os usuários precisam tomar cuidado para pipeta com precisão, manter registros meticulosos, e manter as amostras frias o tempo todo.
Usamos qmi para entender como as vias de transdução de sinal diferenciam entre diferentes tipos de entrada e integram informações de múltiplos receptores.
