Nosso protocolo descreve um método para construir um modelo de RA. Sua taxa de sucesso é de mais de 93% e sua patogênese depende de células T, células B e imunidade inata, o que permite aos pesquisadores estudar melhor a patogênese da RA de uma perspectiva imune global. Então usamos células INKT com efeitos imunomodulatórios para seu tratamento.
As células INKT têm bom efeito no tratamento pela introdução in vivo que fornecem suporte básico de dados para a aplicação clínica de células INKT e realmente explode o valor de aplicação clínica das células INKT. A maior vantagem dessa tecnologia é que ela é simples de operar e fácil de copiar. Demonstrando o procedimento estarão Chen Shengde, Gao Xiang e Zhang Jingnan, estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, pesar 1,75 miligramas de HGPI325 a 339 e HGPI469 a 483 fragmentos e dissolvê-los em 5,25 mililitros de 4 graus Celsius de água tripla destilada. Dissolver o Adjuvante completo de Freund em um banho de água de 50 graus Celsius. Desenhe 5,25 mililitros em outro tubo de centrífuga de 10 mililitros e esfrie-o para uso.
Coloque a mistura da solução HG6PI e a solução Adjuvante da Complete Freund em uma unidade de emulsificação artificial com duas seringas de vidro, conectadas. Em um banho de gelo, empurre a seringa a uma velocidade constante e frequência de dez a vinte vezes por minuto para emulsionar completamente a solução de peptídeo de mistura e completar a solução Adjuvante de Freund. Em seguida, mantenha as gotículas de emulsão na água por dez minutos.
Em seguida, injete 150 microliters dos HG6PIs emulsificados na raiz traseira do mouse subcutânea. Imediatamente e depois de 48 horas, injete 200 miligramas de toxina de coqueluche no camundongo intraperinealmente. Agora, injete o rato DBA1 normal intraperinealmente sem o gausser na dosagem de 0,1 miligramas por quilograma de peso corporal.
Três dias após a modelagem, após a anestesia, isole o baço do mouse. Prepare uma única suspensão celular cortando e moendo o baço em uma peneira de 200 malhas. Lave a suspensão do celular com PBS.
Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos e descartar o supernatante. Suspender as células com um mililitro de solução de tecido sanguíneo inteiro. Adicione três mililitros de meio de separação de linfócitos do rato.
E então centrifugar as células por 20 minutos a 300 vezes g à temperatura ambiente. Para purificar as células INKT, resuspenque 10 para a sétima célula com 100 microliters de quatro graus Celsius PBS, adicione 10 microlitres de alfa gausser carregado CD1 tetramer PE e incuba-los a 4 graus Celsius por quinze minutos no escuro. Lave as células duas vezes com PBS e resuspensá-las em 80 microliters de PBS.
Adicione 20 microliters de microesferas anti-PE e incuba-as a quatro graus Celsius por vinte minutos no escuro. Lave-os duas vezes com PBS e resuspenja as células com 500 microliters de PBS. Coloque a coluna de classificação no campo magnético do classificador MACS e enxágue com 500 microliters de PBS.
Adicione a suspensão da célula preparada à coluna de classificação, colete o fluxo e enxágue três vezes com tampão PBS. Remova o campo magnético e adicione um mililitro de tampão PBS à coluna de classificação. Empurre rapidamente o êmbolo a uma pressão constante para conduzir as células rotuladas para o tubo de coleta.
E obter as células INKT purificadas. Conte com um contador automático de células. Para identificar o fenótipo de células INKT, primeiro, pegue uma vez dez a sexta células das células INKT purificadas e resuspensá-las em 50 microliters de PBS.
Adicione 0,5 microliters de alfa gausser PE CD1 tetramer, ou 10 microliters de FITC TCR beta no tubo de controle positivo único. Adicione 0,5 microliters de alfa gausser PE CD1 tetramer, Adicione 10 microliters de FITC TCR beta no tubo de amostra. Incubar-os a quatro graus Celsius por trinta minutos no escuro.
Depois disso, lave as células em PBS e, em seguida, centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione um mililitro da solução de trabalho de permeabilização de fixação FoxP3. E incubar as células por 45 minutos a 4 graus Celsius no escuro.
Em seguida, adicione um mililitro de solução de trabalho de permeabilização de 1x e centrifugar as células a 500 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernaspeso. Adicione um microliter de AlexaFluor 647 mouse anti-PLZF e um microliter de anti-Tbet de mouse PerCP Cy5.5 e incubar por trinta minutos em temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, adicione dois microliters de solução de trabalho de tampão de permeabilização e centrífuga a 200 vezes g durante cinco minutos para limpeza. Descarte o supernaspeso. Resuspend as células em 500 microliters de PBS e medir por citometria de fluxo.
Neste estudo, em comparação com o grupo controle, os dedões do grupo modelo RA passaram a apresentar inchaço vermelho após modelagem com agravamento gradual. Aos 14 dias, o inchaço vermelho na articulação do tornozelo atingiu o pico seguido de alívio gradual. Os resultados patológicos mostram que o grau de infiltração das células inflamatórias no tecido sinovial do tornozelo dos camundongos modelo RA foi diferente em diferentes estágios.
O pico de inflamação ocorreu no dia 14 após a modelagem. No grupo modelo RA, os níveis de soro de citocinas pró-inflamatórias aumentaram significativamente 11 dias e 14 dias após a modelagem. Enquanto citocinas anti-inflamatórias diminuíram significativamente.
Este número mostra que a taxa de INKT2 em camundongos normais foi de cerca de 5%. A taxa de INK2 foi de cerca de 82% após indução in vivo. A taxa de INK2 foi de mais de 92% após a purificação do MACS.
Aqui mostramos um método para emulsionar o polipeptídeo principal que vemos em RA. As gotículas emulsificadas são mantidas na água por 10 minutos. Os resultados estão se dispersando. Este protocolo é um novo complemento para o tratamento de células NKT especiais levantadas por RA.
Que pode ser aplicada para a imunoterapia celular ou outras doenças e tumores autoimunes. Este modelo pode estimular a proliferação global de células CD4 T e déficits de células NKT em pacientes com RA, o que estabelece as bases para um estudo aprofundado das vias imunológicas de RA. Neste protocolo, a toxina da coqueluche é injetada interperitonealmente durante a modelagem.
Por favor, use roupas experimentais e luvas descartáveis. E levar todos os padrões de operação para evitar a facada de uma infecção.
