Nossa compreensão da morfogênese ocular vem de estudos anteriores de tecido fixo. No entanto, esses estudos careciam de dinâmica celular e tecidual. Usando imagens de lapso de tempo, somos capazes de capturar todo esse processo para visualização e análise.
Nosso método que aproveita o desenvolvimento externo na clareza óptica dos embriões de zebrafish, que facilitam a imagem ao vivo, e usa microscopia confocal de varredura a laser que está prontamente disponível na maioria dos campi de pesquisa. Os pesquisadores novos neste método devem esperar alguma tentativa e erro antes de obter um conjunto de dados utilizável. Muitos passos, especialmente as injeções e incorporação, devem ir bem para o sucesso, por isso tenha paciência.
Uma vez que o zebrafish comece a procriar, enquanto espera de 15 a 20 minutos para garantir que os ovos se tornem fertilizados, use uma pipeta P10 e pontas de microliter P10 para trás carregar uma agulha de micro injeção capilar de vidro puxada com 2,5 a 5 microliters da diluição de RNA de interesse. Quando os ovos estiverem prontos, use uma pipeta de transferência e um microscópio dissecando para carregar cuidadosamente os ovos no molde de injeção, usando fórceps para rolar os embriões de tal forma que a única célula seja visível conforme necessário. Em seguida, injete todos os embriões no estágio de uma célula, visando a célula e não a gema para garantir uma rotulagem uniforme do embrião em desenvolvimento.
Em cerca de 11 horas após a fertilização, coloque uma alíquota de um a cinco mililitros de 1,6% de derretimento baixo em meio E3 em um bloco de calor de 42 graus Celsius e use um microscópio de fluorescência para testar embriões injetados com sucesso com um brilho geral de floresnce. Conte os somites para encenar adequadamente os embriões. Em 11 horas após a fertilização, três somitas devem ser observadas.
Uma amostra ideal terá fortes sinais EGFP e mCherry e estará no estágio correto de desenvolvimento. Antes de montar, coloque os embriões em um prato revestido de ágar e use fórceps para remover o acorde de cada embrião. Quando todos os embriões forem desnudados, use uma pipeta de rolo de vidro para aspirar um embrião.
Ejete o máximo de E3 possível para que o embrião fique na ponta da pipeta Pasteur de vidro e solte o embrião no tubo de agarose do bloco de calor. Deixe os embriões afundarem na agarose por alguns segundos antes de aspirar um pequeno volume de agarose junto com o embrião, tomando cuidado para que o embrião permaneça na ponta da pipeta. Ejete o embrião e agarose em uma gota de agarose em um prato de fundo de vidro e use rapidamente, mas cuidadosamente, fórceps para orientar o lado dorsal do embrião para baixo antes que a gota agarose endureça.
Depois de montar de 10 a 12 embriões da mesma maneira, adicione agarose suficiente para cobrir completamente o fundo do prato envolvendo todas as gotículas em um único disco de agarose. Quando a agarose endureceu, a camada E3 sobre a agarose para manter as amostras hidratadas. Depois de definir o microscópio confocal de varredura a laser para os parâmetros apropriados para a imagem de lapso de tempo, reveste liberalmente a parte inferior do vidro com meio de imersão correspondente ao índice de refração da água, tomando cuidado para evitar bolhas de ar, e aplique uma pequena gota de meio de imersão ao objetivo de água 40X.
Fixar a placa de fundo de vidro na inserção do palco e adicionar meio E3 adicional para manter os embriões úmidos durante a noite. Use argila de modelagem para selar a tampa de plástico sobre o prato e elevar o objetivo de fazer contato com o prato. Sob a posição do software de microscópio, clique em adicionar para salvar as informações XYZ da primeira amostra a serem lapsadas por tempo e selecione uma amostra com uma fluorescência forte e montagem ideal.
Na guia localizar, procure a próxima amostra e clique na posição e adicione para selecionar a amostra conforme demonstrado. Quando todas as amostras tiverem sido selecionadas, destaque a primeira posição e clique em mover-se para. Ao digitalizar continuamente, foreça a vesícula óptica dentro do quadro, deixando amplo espaço nas regiões anterior e distal em relação à vesícula óptica e cérebro.
Para atribuir a primeira e última fatias Z, selecione definir primeiro e definir por último enquanto se move através da direção Z com o botão de foco fino, mantendo um número total de fatia de cerca de 63 para acomodar o crescimento do copo óptico. Inclua espaço extra no lado ventral do vesículo óptico para permitir espaço para crescimento. Uma vez que as primeira e últimas fatias Z tenham sido definidas, clique em C para mover-se para o centro da pilha Z e ajustar a potência do laser e ganhar para ambos os lasers.
Quando a potência e o ganho do laser tiverem sido definidos, pare a varredura e clique em atualizar as informações de posição. Para passar para a próxima posição, clique na posição dois. Uma vez definidas as primeiras e últimas fatias Z como demonstrado, abra a direção da série temporal e defina o número de ciclos para 300 e o intervalo de tempo para 2,5 minutos.
Depois de revisar as configurações para ter certeza de que tudo está finalizado, clique em começar o lapso de tempo e confirme que a primeira rodada de imagem é capturada corretamente antes de permitir que o lapso de tempo seja executado durante a noite. A injeção direta na célula única é necessária para uma rotulagem uniforme e uma fluorescência robusta. Após sua imersão em agarose, os embriões devem ser espaçados uniformemente por todo o prato.
Se os embriões forem encenados corretamente, suficientemente fluorescentes e adequadamente montados, permanecerão no quadro de imagem durante o lapso de tempo, permitindo que todo o órgão seja imageado. Amostras que não são orientadas ao longo do eixo dorsal, como as horizontais ou diagonais, crescerão fora do quadro de imagem à medida que o lapso de tempo prossegue e não podem ser usadas para análises posteriores. Um embrião que é sobre-girado resultará em um lapso de tempo mais posterior.
Um embrião que é sub-girado permitirá apenas o tecido mais anterior ser observado. Além disso, amostras que são montadas com relação à orientação do quadro são mais propensas a produzir um lapso de tempo bem sucedido. Este viés em direção ao lado ventral fornece espaço extra para o crescimento do tecido na direção ventral, resultando em um lapso de tempo ideal.
Quando esses critérios não forem atendidos, o lapso de tempo não capturará mais todo o volume 3D do tecido à medida que se desenvolve e não pode ser usado para análises posteriores. Esses conjuntos de dados ricos em informações podem ser analisados de muitas maneiras, incluindo rastreamento de células 4D com quantificações de velocidade e trajetória celular, medições de volume de células e tecidos e visualizações 3 e 4D.
