Este protocolo é ideal para avaliar a capacidade da microcirculação cerebral de regular seu próprio fluxo sanguíneo durante as alterações da pressão arterial em condições normais e patológicas. O LDF fornece um método relativamente não invasivo para o monitoramento contínuo do fluxo sanguíneo cerebral sob uma variedade de condições que não é possível com outros métodos. A metria de fluxo de laser Doppler pode ser usada para avaliação do fluxo sanguíneo não invasivo.
Por exemplo, para avaliar os efeitos de uma dieta rica em sal na regulação do fluxo sanguíneo prejudicado em mulheres jovens saudáveis. O LDF permite que o fluxo sanguíneo seja facilmente monitorado em muitos leitos vasculares diferentes de humanos e animais, e pode ser usado em uma ampla variedade de estudos. Demonstrando o procedimento com Adrienne Allen será Megan Stumpf, minha tecnóloga de pesquisa e gerente de laboratório.
Antes de iniciar o procedimento, coloque o rato em um manta de água circulante mantido a 37 graus Celsius e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato experimental anestesiado. Aplique pomada nos olhos dos animais e raspe a parte superior do crânio, área do pescoço ventral e triângulos femorais. Remova qualquer perda de cabelo da pele exposta.
E desinfetar a pele com álcool esfregando. Mova o rato para uma almofada de aquecimento com uma bomba de água morna circulante. E use fita médica para fixar temporariamente o rato na posição supina.
Encha duas cânulas PE 50 com uma unidade por mL de heparina em solução isotônica de cloreto de sódio. E desnível a extremidade aberta dos cateteres com tesoura cirúrgica para facilitar a inserção nas artérias. Depois de separar cuidadosamente as artérias femorais do tecido circundante sob um microscópio dissecando, ligar a extremidade distal do segmento isolado da artéria femoral e colocar duas suturas adicionais ao redor das extremidades média e proximal da artéria sem apertar os nós.
Insira um fio em forma de V feito a partir de um clipe de papel sob a artéria para ocluir o vaso até que a cânula tenha sido presa. Em seguida, use uma tesoura de vannas para fazer uma pequena incisão na artéria femoral perto da ligadura distal. Insira a extremidade chanfrada da cânula na incisão e avance a cânula na artéria femoral.
Remova o clipe de papel. Aperte o nó na ligadura do meio sobre a cânula para fixar a cânula no lugar. Solte a tensão na ligadura de elevação, em seguida, aperte a ligadura proximal e feche a incisão.
Imediatamente após a colocação das cânulas, coloque o animal em posição severa. E fixar a cabeça em um dispositivo estereotaxista tomando cuidado para não desalojar os cateteres. Faça uma incisão elíptica na pele cobrindo o crânio.
E use um cotonete para remover qualquer tecido conjuntivo, garantindo que o crânio esteja limpo e seco. Coloque um pequeno pedaço de papel de tecido alongado enrolado ao redor da incisão no couro cabeludo para parar qualquer sangramento e sob o microscópio dissecando, use uma broca de tamanho apropriado com uma broca de 2,15 mm para afinar uma área de 0,5 a 1 cm de osso na área parietal sobre o córtex somatossensorial esquerdo ou direito, dependendo do tamanho do rato. Afina o osso lentamente e cuidadosamente para evitar penetrar no crânio.
Ao realizar esta etapa, a solução salina deve ser aplicada liberalmente para evitar que a área sobreaque o aquecimento. Quando a área tiver uma aparência rosa e/ou vasos sanguíneos podem ser visualizados, cubra o osso diluído com óleo mineral. E use um micromanipulador para posicionar a sonda doppler laser sobre a microcirculação cerebral exposta de modo que a ponta da sonda esteja apenas tocando o topo da piscina de óleo mineral.
Para a colocação inicial da sonda, é melhor começar com um sinal de aproximadamente 150 unidades para garantir que a sonda esteja posicionada sobre a micro circulação. Quando a sonda de fluxo de doppler laser estiver no lugar, permita que o animal descanse por um período de equilíbrio de 30 a 45 minutos antes de retirar 1,5 mL de sangue da cânula da artéria femoral apropriada durante um período de 30 segundos. Para manter a patente do cateter, infundir 100 unidades por mL de heparina em soro fisiológico isotônico na cânula após cada coleta de sangue.
Deixe o rato se recuperar por dois minutos e, em seguida, meça LDF e pressão arterial a cada 30 segundos por dois minutos. Após as medidas de pressão arterial e LDF, repita a retirada do volume sanguíneo a cada dois minutos até que o animal atinja uma pressão arterial média de aproximadamente 20mmHg. Nestes experimentos representativos, o fluxo sanguíneo médio cerebral a laser de 10 ratos Sprague-Dawley alimentados com chow de laboratório padrão foi mantido dentro de 20% do valor pré-hemorragia após as três primeiras retiradas de volume sanguíneo, até que a pressão arterial média atingiu o limite mais baixo de autoregulação.
As subsequentes retiradas de volume sanguíneo em pressões abaixo do limite inferior da autoregulação, causaram uma redução progressiva do fluxo sanguíneo cerebral a laser demonstrando que a circulação cerebral não era mais capaz de produzir um nível suficiente de vasodilatação para manter o fluxo sanguíneo cerebral constante nas pressões de profusão mais baixas. Nas pressões acima ou acima do limite inferior de autoregulação, não houve correlação significativa entre o fluxo sanguíneo cerebral laser e a pressão arterial, indicando que o fluxo sanguíneo cerebral a laser era independente da pressão arterial na faixa platô da curva autoregulatória. Abaixo do limite inferior da autoregulação, a relação de pressão arterial de fluxo sanguíneo cerebral a laser teve uma inclinação negativa.
E o fluxo sanguíneo cerebral a laser estava significativamente correlacionado com a pressão arterial. As coisas mais importantes a se lembrar são afinar o crânio com muito cuidado e garantir que a sonda LDF permaneça firmemente ancorada sobre a mesma área de tecido. Este procedimento pode ser utilizado para testar a reatividade da microcirculação de vários agentes após a infusão retrógrada através da artéria carótida, ou para avaliar a hiperemia funcional e o acoplamento neurovascular na circulação cerebral.
Essa técnica possibilitou a investigação dos efeitos de diferentes fármacos e anestésicos na circulação cerebral e as alterações na autoregulação cerebral em modelos de doenças como a hipertensão.
