O diamante é o primeiro método de código aberto para a avaliação quantitativa da função cardíaca segmental quadridimensional em embriões de zebrafish. Nosso método tem uma resolução de micrômetros que pode quantificar a mecânica cardíaca local em espaço 3D. Nenhuma outra abordagem atual permite isso.
Diamante desvenda novos padrões de lesões na toxicidade cardíaca induzida pela doxorubicina. Portanto, acreditamos que nosso método poderia ser usado como uma plataforma para alta produtividade no rastreamento vivo para toxicidade cardíaca induzida pela quimioterapia. Estamos trabalhando para adaptar Diamante ao coração dos mamíferos.
No entanto, é necessário um trabalho adicional para levar em conta a orientação da fibra muscular cardíaca dos mamíferos e o movimento rotacional e torcido. Ao tentar esse método, é muito importante que o usuário tenha uma visualização clara da estrutura anatômica do coração zebrafish para identificar corretamente os eixos horizontais e verticais e segmentar o ventrículo. Para reconstruir o coração sistólico e diastólico 3D, comece abrindo a pasta criada pelo algoritmo pós-sincronização e abra a pasta de saída.
Encontre a primeira fase sistólica e diastólica e regissumbe o número do quadro. Em seguida, abra a saída por pasta estadual e encontre as pastas que têm os mesmos números dos números de quadros registrados. Converta as imagens na pasta em arquivos TIF 3D e nomeie-as diastole.
tif e systole.tif. Para realizar a segmentação do ventrículo, abra o software de análise de imagens clicando em arquivo e dados abertos. Em seguida, carregar diastole.
tif e systole. tif e digite o tamanho do voxel de acordo com as configurações de imagem. Clique no painel de segmentação e segmente manualmente a parte ventrícula do coração usando a ferramenta de limiar incorporada.
Em seguida, remova o canal atrioventricular e o trato de saída no ventrículo segmentado, pois isso afetará a análise de deslocamento. Após a segmentação ser concluída, clique no painel do projeto, clique com o botão direito do mouse nas etiquetas diastole.labels. tif e systole.labels.
tif tabs no console e clique em exportar dados para salvar os dados como arquivos TIF 3D. Abra prepimage_1. m no ambiente de programação, certifique-se de que a pasta em InPath on line cinco contém os arquivos TIF originais e segmentados e altere a fatia no live four para o número de fatias dos arquivos TIF 3D.
Após a execução do código, serão gerados cinco novos arquivos 3D TIF e duas novas pastas. Importe todos os cinco arquivos 3D TIF para o software de análise de imagem. Vá ao painel multiplanar e escolha diastole_200.
tif como os dados primários. Alinhe o eixo x com o eixo longo vertical do ventrículo e o eixo z com o eixo longo horizontal do ventrículo. Em seguida, escolha três pontos aleatórios do plano YZ oblíquo de forma anti-horário e regissão suas coordenadas de posição 3D.
Repita este processo para systole_200.tif. Clique no painel do projeto e crie um objeto de fatia para diastole_200. tif clicando com o botão direito do mouse em diastole_200.
tif e procurando o objeto fatiado. Clique à esquerda no objeto de fatia criado, verifique o plano definido nas opções do painel de propriedades, escolha três pontos na definição do plano e insira as coordenadas gravadas anteriormente. clique com o botão direito do mouse diastole_200.
tif, procure por resample imagem transformada e crie o objeto. No painel propriedades, escolha fatia como referência e clique em aplicar que deve gerar um objeto chamado diastole_200.transformado. Em seguida, clique com o botão direito do diastole_200.
transformado, procure reamosple e crie o objeto. Escolha o tamanho do voxel como o modo e altere-o para x é igual a um, y é igual a um, e z é igual a um no painel de propriedades. Clique em aplicar e salvar o diastole_200 gerado.
objeto resamplificado como um arquivo TIF 3D. Repita este processo para dialabel. tif, teste.
tif, systole_200. tif, syslabel. tif, e teste.
tif de acordo com as instruções do manuscrito. Importe todos os seis arquivos resamplados para ImageJ e selecione a fatia de systole_200. resampled em que o canal atrioventricular é claramente visualizado certificando-se de registrar o número da fatia.
Use a função de rotação de transformação da imagem para posicionar verticalmente o canal atrioventricular. Aplique a mesma rotação em todos os arquivos e feche todas as janelas e salve as alterações. Em seguida, mova-se systole_200.
resampled, syslabel. resampled, e teste2. reamtravado para a pasta resample_sys.
Mova-se diastole_200. resampled, dialabel. resampled, e teste.
reamtravado para a pasta resample_dia. Abra divider_2_8_pieces. m e alterar InPath na linha cinco para o diretório de imagens.
Altere a variável meio na linha 22 para o número de fatia onde o canal atrioventricular é claramente visualizado. Repita este processo para diastole_200. resamplados nas linhas 394 e 411.
Execute o código. Quando solicitado, clique uma vez no centro do ventrículo e no centro do canal atrioventricular. Para registrar matrizes de imagem sistólica e diastólica, abra register_3.
m e alterar InPath na linha quatro para o caminho da pasta de imagem. Então abra displacement_4. m e alterar o InPath para o caminho da pasta de imagem.
Execute o programa para gerar um vetor8. txt arquivo com uma matriz oito por quatro. Cada linha da matriz contém as magnitudes do componente x, componente y, componente z, e a magnitude da soma do vetor de deslocamento de um segmento específico do ventrículo.
Esses valores podem então ser transferidos para uma planilha. Este protocolo foi usado para descobrir a heterogeneidade segmental da função cardíaca e a suscetibilidade à lesão miocárria induzida pela doxorubicina em zebrafish. Após um tratamento de doxorubicina 24 horas de três a quatro pós-fertilização, o deslocamento dos segmentos ventriculares foi comparado entre o controle e os grupos tratados.
Sob condições de controle, os segmentos basais um e seis sofrem os maiores deslocamentos e são os mais suscetíveis à lesão cardíaca induzida por doxibicina. Aos seis dpf, a norma L2 média dos vetores de deslocamento segmental no peixe controle variou de 3,9 a 8% após a normalização. Os segmentos basais um e seis recuperaram o deslocamento de Diamante para controlar níveis sugerindo regeneração segmentar.
Enquanto isso, uma piora na cepa basal 2D de 53 negativos para 38% negativos foi observada imediatamente após o tratamento da doxorubicina, seguida por um retorno aos níveis de controle 48 horas depois corroborando os resultados de deslocamento de Diamante. Também foi observada uma diminuição paralela e recuperação da fração de ejeção global ou EF em resposta ao tratamento. O diamante foi então aplicado durante o tratamento da doxorubicina e modulação da via do entalhe usando o inibidor de entalhe DAPT e os efeitos a jusante NICD e NRG1 mRNA.
A microinjeção mRNA resgatou a diminuição do deslocamento de Diamante e EF após lesão aguda induzida pela quimioterapia. Além disso, a inibição da via do entalhe após a quimioterapia dificultou a recuperação do deslocamento de Diamante dos segmentos basais e EF 48 horas após o tratamento, mas a inibição foi resgatada pelos efeitos a jusante do entalhe. A fração de ejeção tradicional é conhecida por ser um indicador insensível e atrasado da lesão do miocárdio.
O diamante permite que os pesquisadores quantifiquem a função cardíaca focal e ajudem a heterogeneidade na lesão do miocárdio em embriões de zebrafish.
