Diamond è il primo metodo open source per la valutazione quantitativa della funzione cardiaca segmentale quadridimensionale negli embrioni di zebrafish. Il nostro metodo ha una risoluzione del micrometro in grado di quantificare la meccanica cardiaca locale nello spazio 3D. Nessun altro approccio attuale lo consente.
Diamond svela nuovi modelli di lesioni nella tossicità cardiaca indotta da doxorubicina. Pertanto, crediamo che il nostro metodo potrebbe essere utilizzato come piattaforma per lo screening in vivo ad alta produttività per la tossicità cardiaca indotta dalla chemioterapia. Attualmente stiamo lavorando per adattare Diamond al cuore dei mammiferi.
Tuttavia, è necessario un lavoro aggiuntivo per tenere conto dell'orientamento della fibra muscolare cardiaca dei mammiferi e del movimento rotazionale e torsione. Quando si tenta questo metodo, è molto importante che l'utente abbia una chiara visualizzazione della struttura anatomica del cuore di zebrafish per identificare correttamente gli assi orizzontale e verticale e segmentare il ventricolo. Per ricostruire il cuore sistolico e diastolico 3D, iniziare aprendo la cartella creata dall'algoritmo di post-sincronizzazione, quindi aprire la cartella di output.
Individuare la prima fase sistolica e diastolica e registrare il numero di frame. Quindi apri l'output per cartella di stato e trova le cartelle che hanno gli stessi numeri dei numeri di fotogramma registrati. Convertire le immagini nella cartella in file TIF 3D e denominarle diastole.
tif e systole.tif. Per eseguire la segmentazione del ventricolo, aprire il software di analisi delle immagini facendo clic su file e apri dati. Quindi caricare diastole.
tif e sistole. e immettere le dimensioni del voxel in base alle impostazioni dell'immagine. Fate clic sul pannello di segmentazione e segmentate manualmente la parte ventricolare del cuore utilizzando lo strumento soglia incorporato.
Quindi rimuovere il canale atrioventricolare e il tratto di deflusso nel ventricolo segmentato perché ciò influenzerà l'analisi di spostamento. Al termine della segmentazione, fate clic sul pannello progetto, fate clic con il pulsante destro del mouse sul file diastole.labels. tif e systole.labels.
tif nella console e fare clic su Esporta dati per salvare i dati come file TIF 3D. Aprire prepimage_1. m nell'ambiente di programmazione, assicurarsi che la cartella in InPath nella riga cinque contenga i file TIF originali e segmentati e modificare la sezione in live four in base al numero di sezioni dei file TIF 3D.
Dopo aver eseguito il codice, verranno generati cinque nuovi file TIF 3D e due nuove cartelle. Importa tutti e cinque i file TIF 3D nel software di analisi delle immagini. Vai al pannello multiplanar e scegli diastole_200.
come dati primari. Allineare l'asse x con l'asse lungo verticale del ventricolo e l'asse z con l'asse lungo orizzontale del ventricolo. Quindi, scegliete tre punti casuali dal piano YZ obliquo in senso antiorario e registrate le coordinate di posizione 3D.
Ripetere questo processo per systole_200.tif. Fate clic sul pannello progetto e create un oggetto slice per diastole_200. cliccando con il pulsante destro del mouse diastole_200.
e la ricerca dell'oggetto slice. Fate clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto slice creato, selezionate il piano impostato nelle opzioni del pannello delle proprietà, scegliete tre punti nella definizione del piano e immettete le coordinate registrate in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse diastole_200.
tif, cercare di ricampionare l'immagine trasformata e creare l'oggetto. Nel pannello delle proprietà, scegliete slice come riferimento e fate clic su applica che deve generare un oggetto denominato diastole_200.transformed. Fare quindi clic con il pulsante destro del mouse diastole_200.
trasformato, cercare di ricampionare e creare l'oggetto. Scegliete la dimensione voxel come modalità e modificatela in x uguale a una, y ne è uguale a una e z ne è uguale una nel pannello delle proprietà. Fare clic su Applica, quindi salvare la diastole_200.
oggetto ricampionato come file TIF 3D. Ripetere questo processo per dialabel. tif, test.
Tif, systole_200. tif, syslabel. tif, e test.
secondo le indicazioni manoscritte. Importare tutti e sei i file ricampionati in ImageJ e selezionare la sezione systole_200. ricampionato in cui il canale atrioventricolare è chiaramente visualizzato assicurandosi di registrare il numero della fetta.
Utilizzare la funzione di rotazione della trasformazione dell'immagine per posizionare verticalmente il canale atrioventricolare. Applicare la stessa rotazione a tutti i file, quindi chiudere tutte le finestre e salvare le modifiche. Quindi, muoviti systole_200.
ricampionato, syslabel. ricampionato e test2. ricampionato nella resample_sys cartella.
Spostati diastole_200. ricampionato, dialabel. ricampionato e test.
ricampionato nella resample_dia cartella. Aprire divider_2_8_pieces. m e modificare InPath nella riga cinque nella directory delle immagini.
Modificare il centro variabile nella linea 22 con il numero della fetta in cui il canale atrioventricolare è chiaramente visualizzato. Ripetere questo processo per diastole_200. ricampionato sulle linee 394 e 411.
Eseguire il codice. Quando richiesto, fare clic una volta al centro del ventricolo e al centro del canale atrioventricolare. Per registrare matrici di immagini sistoliche e diastoliche, aprire register_3.
m e modificare InPath nella riga quattro nel percorso della cartella dell'immagine. Quindi apri displacement_4. m e modificare InPath nel percorso della cartella dell'immagine.
Eseguire il programma per generare un vettore8. txt con una matrice otto per quattro. Ogni riga della matrice contiene le grandezze della componente x, la componente y, la componente z e la grandezza della somma del vettore di spostamento di uno specifico segmento del ventricolo.
Questi valori possono quindi essere trasferiti in un foglio di calcolo. Questo protocollo è stato utilizzato per scoprire l'eterogeneità segmentale della funzione cardiaca e la suscettibilità alla lesione miocardica indotta dalla doxorubicina nel pesce zebra. Dopo un trattamento doxorubicina di 24 ore da tre a quattro post-fecondazione, lo spostamento dei segmenti ventricolari è stato confrontato tra gruppi di controllo e trattati.
In condizioni di controllo, i segmenti basali uno e sei subiscono gli spostamenti più grandi e sono quelli più suscettibili alla lesione cardiaca indotta dalla doxorubicina. A sei dpf, la norma media L2 dei vettori di spostamento segmentale nel pesce di controllo variava dal 3,9 all'8% dopo la normalizzazione. I segmenti basali uno e sei hanno recuperato lo spostamento del diamante per controllare i livelli suggerendo la rigenerazione segmentale.
Nel frattempo, un peggioramento del ceppo basale 2D da -53 a negativo 38% è stato osservato immediatamente dopo il trattamento con doxorubicina seguito da un ritorno ai livelli di controllo 48 ore dopo che ha confermato i risultati dello spostamento diamond. È stata osservata anche una diminuzione parallela e il recupero della frazione di espulsione globale o EF in risposta al trattamento. Il diamante è stato quindi applicato durante il trattamento con doxorubicina e la modulazione della via della tacca utilizzando l'inibitore della tacca DAPT e gli effettori a valle NICD e NRG1 mRNA.
La microiniezione di mRNA ha salvato la diminuzione dello spostamento di Diamante e dell'EF dopo una lesione acuta indotta dalla chemioterapia. Inoltre, l'inibizione della via della tacca dopo la chemioterapia ha ostacolato il recupero dello spostamento diamond dei segmenti basali e dell'EF 48 ore dopo il trattamento, ma l'inibizione è stata salvata dagli effettori a valle della tacca. La frazione di espulsione tradizionale è nota per essere un indicatore insensibile e ritardato della lesione del miocardio.
Diamond consente ai ricercatori di quantificare la funzione cardiaca focale e assistere l'eterogeneità nella lesione del miocardio negli embrioni di zebrafish.
