Este protocolo pode ajudar a manter a estabilidade da carga, que pode ser tanto pequenas moléculas quanto proteínas, através do uso do polibole, que por sua vez pode reduzir as interações de carbono com o solvente. Esta nova técnica pode ser usada para melhorar a cobertura vacinal nos países em desenvolvimento, uma vez que as funcionalidades vacinais podem ser muitas vezes comprometidas devido a instalações de transporte e armazenamento ineficientes. Para fabricar os polibolhas, primeiro use uma pipeta de transferência de um mililitro para adicionar 800 microliters de 10% CMC em um frasco de vidro de 0,92 mililitro.
Para sintetizar o PCLTA, misture 1.000 gramas por mililitro de 14 kilodalton PCL em 200 microliters de DCM. Para sintetizar PLGADA, misture 1.000 gramas por mililitro de cinco kilodalton PLGADA em 200 microliters de clorofórmio. Misture o fotoinitiador com a mistura de polímero de interesse a uma proporção de 0,005 a 1 e carregue 200 microliters da solução resultante em uma seringa de vidro de um mililitro montada em uma bomba de seringa conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com diâmetro interno de 0,016 polegadas.
Usando um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero, injete o polímero no frasco de 10%CMC no frasco de vidro para formar os polibolhas e curar os polibolhas sob luz ultravioleta em um comprimento de onda de 254 nanômetros por 60 segundos a dois watts por centímetro quadrado, em seguida, o flash congele os polibolhas em nitrogênio líquido por 30 segundos e liofilize os portadores durante a noite a 0,01 milibarbar de vácuo em menos 85 graus Celsius. Para centralizar a carga de interesse dentro de um polibole, misture a carga com 5% cmc em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga antes de injetar manualmente dois microliters da mistura de carga no polibole. Quando toda a carga tiver sido injetada, re-curar, congelar flash e liofilizar o polibole injetado como apenas demonstrado.
Na manhã seguinte, use fórceps para separar o polibole do CMC seco e lavar o polibole com água deionizada para remover qualquer CMC residual. Em seguida, corte o polibole ao meio e imagem as metades por microscopia confocal para garantir que a carga esteja centrada. Para a liberação de carga de pequenas moléculas, incubar os polibolhas com acriflavina centrada em 400 microliters de PBS a 37 graus Celsius para o comprimento de incubação apropriado.
A cada ponto de tempo experimental, colete o supernascer e adicione 400 microliters de PBS fresco ao frasco. Em seguida, use um leitor de placas para quantificar a intensidade de fluorescência do supernatante coletado. Para ativação infravermelha próxima, misture a solução de polímero com nano hastes de ouro hidrofobicizadas a uma proporção de um a nove e adicione o iniciador fotográfico a uma proporção de 0,005 a 1.
Injete a mistura resultante em um frasco de vidro de 0,92 mililitro contendo 800 microliters de 10% CMC e cure os polibolhas sob luz ultravioleta, como demonstrado. Após o congelamento e a liofilização como demonstrado, lave os polibolhas com água deionizada e incuba os portadores em 400 microlitadores de PBS a 37 graus Celsius para o período de incubação adequado. No final da incubação, obtenha uma imagem infravermelha prospectiva do polibole antes e depois de ativar os polibolhas com um laser infravermelho de 801 nanômetros em oito amperes por cinco minutos três vezes por semana durante quatro semanas para polibolhas PLGADA e 14 semanas para polibolhas PCL-PCLTA.
A cada ponto de tempo experimental, colete o supernascer e adicione 400 microliters de PBS fresco ao frasco. Em seguida, calcule as diferenças de temperatura entre os polibolhas antes e depois da ativação do laser com base nos valores de temperatura das imagens infravermelhas prospectivas. A adição de uma solução aquosa baseada em 10% CMC resulta em uma suspensão completa de polibobo para uma manutenção bem sucedida da esferoférico de poliboles.
A injeção de carga no polibole na ausência de CMC resulta em vazamento e consequente falta de retenção de carga dentro do polibole. Para lidar com esse vazamento, a viscosidade do PCLTA pode ser aumentada usando carbonato de potássio isolado após o corte final de policaprolactona com triacrilato e a viscosidade da carga pode ser aumentada misturando a carga com 5%CMC. A viscosidade dos polibolhas PLGADA é suficiente para facilitar o centro da carga e não requer modulação via carbonato de potássio.
Note que nenhuma diferença estatisticamente significativa na eficiência vinculante do anticorpo é observada após a mistura do antígeno HIV gp120/41 com e sem trehalose antes da injeção de polibole. Liberações de rajadas são observadas em polibolhas PLGADA com acriflavina no meio do dia 19 para polibolhas incubadas a 37 graus Celsius e no quinto dia para polibolhas incubadas a 50 graus Celsius. Além disso, os polibolhas PLGADA e os polibolhas PCL e PCLTA contendo nanoducos de ouro podem ser ativados com sucesso a laser várias vezes.
Ao formar os polibolhas, tome cuidado para proteger os reagentes da luz e também para usar as soluções imediatamente. Depois de desenvolver essa tecnologia, também queríamos explorar a automatização desse processo para ampliar a produção de polibolhas.
