The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

1. Preparação de Meios de Cultura e Pratos <ol><li> Adicione 200 ml de Biggers Whitten e Whitten (PD) 17 Solução de trabalho pela adição de 5,54 g de NaCl, 0,356 g de KCl, 0,25 g de CaCl2, 0,162 g de H 2 KO 4 P, e 0,294 g de MgSO4 e 1 L de água Milli-Q . Esta é a solução estoque e pode ser mantida a 4 ° C durante até um mês. </li><li> A partir da solução estoque, adicionar 420 mg de NaHCO3 -, 200 mg de glucose, 6 mg de piruvato de sódio, 600 mg de albumina de soro bovino, 0,74 ml lactato de sódio, e 4,0 ml de tampão HEPES a 193 ml do estoque de BWW. Esta é a solução de trabalho e é sempre frescos no dia e equilibrou-se a 37 ° C antes de usar. </li><li> Para fazer com que a cânula, ter de polietileno (PE), tubagem com um diâmetro interno de 0,4 mm e um diâmetro externo de 1,1 mm e mantenha em fogo baixo (tipicamente metanol chama) de tal modo que o tubo começa a derreter. Tire imediatamente a tubulação outward para esticar e fazer o diâmetro exterior mais estreito. </li><li> Cut para produzir um estreitamento de uma extremidade que permite a fácil punção dos vasos deferentes. </li><li> Cortar a outra extremidade da cânula até cerca de 15 cm. Inserir uma agulha G 30 no fim brusco, e anexar uma seringa de 3 ml para ele (totalmente retraída). </li><li> Adicione um bocal de sucção por um corte 20 cm de comprimento de tubagem de PE (4,2 mm de diâmetro interno, 6,4 mm de diâmetro exterior). Insira um porta-voz em uma das extremidades. </li><li> Insira o suporte tubo de vidro a micro-capilar e da própria micro-capilar de vidro (tipicamente 3 ul para um rato, 40 ul para um rato). </li></ol> 2. Remoção de epidídimos de Mouse <ol><li> Eutanásia ratos de acordo com os procedimentos aprovados IACUC específicas para cada instituição. </li><li> Leve o animal e fazer uma pequena incisão no escroto para expor o epidídimo. Puxe o testículo e epidídimo para fora da cavidade usando um par de # 5 pinças de relojoeiro. </li><li> Cortam os canais deferentes de tal modo que, pelo menos, 1-2 cm de permanecer ligados à cauda do epidídimo. Além disso, cortar os ductos eferentes proximais e tecidos de ligação do epidídimo ao testículo e remover a faixa reprodutiva masculina inteira. </li><li> Coloque a faixa reprodutor masculino inteira sob um microscópio de dissecação com uma gama de ampliação na ordem de 5-40X. </li></ol> 3. canulação do epidídimo <ol><li> Fita para baixo da cânula para o microscópio, de tal modo que 1-2 cm da extremidade (em forma de cone) estreitada é livre e visível através da lente. </li><li> Pegue um par de # 5 pinças de relojoeiro e apertar suavemente cada lado do canal deferente e puxe o canal deferente para a cânula, de tal modo que a cânula vai para os canais deferentes. </li><li> Pegue um pedaço de não-absorvível trançado preto de seda tratado (tamanho 5-0) e dê um nó em torno dos vasos deferentes canulados. Verifique se o nó é puxado com força para segurar a cânula no interior dos vasos deferentes, quando a pressão do ar from a seringa é aplicado. </li></ol> 4. Retrograde ou Backflushing do caudal do epidídimo Espermatozóides <ol><li> Usando relojoeiros # 5 fórceps, pegue a extremidade distal dos epidídimos Cauda e remover a túnica albugínea, a fim de expor um único túbulo epidídimo. </li><li> Usando a pinça, puxe para fora do túbulo para expor e, em seguida, provocar uma separação, de modo a criar uma abertura para o esperma para ser liberado. </li><li> Suavemente empurrar os 3 ml (rato) ou 20 ml (rato) de seringa, de modo a expelir o ar a partir da seringa para dentro do vaso deferente. À pressão adequada, espermatozóides vai começar a sair lentamente do túbulo quebrada na extremidade distal da cauda do epidídimo. Neste momento, para aplicar sucção do bocal para desenhar os espermatozóides no capilar de vidro. Nota: Tipicamente, um rato, 2-3 ul de espermatozóides pode ser obtida, dependendo da idade do animal. A vontade de rato, no rendimento médio de 30-40 mL. </li></ol> 5. LavarLise e espermatozóides em Preparação para Proteomics <ol><li> Expulsar os espermatozóides do capilar de vidro, em 1 ml de solução de solução de BWW (37 ° C), soprando suavemente para dentro do bocal ou anexar uma seringa e expelir o ar de modo a empurrar os espermatozóides de volta para fora do capilar. </li><li> Uma vez que os espermatozóides são difundidos, lavar 3x (300 x g, 5 min) com 1 ml BWW para remover proteínas contaminantes. Após a lavagem final, remover o sobrenadante. Nota: Neste ponto, as células de esperma podem ser congeladas para uso posterior. </li><li> Solubiliza-se proteínas utilizando 4% CHAPS, 2 M tioureia, e Tris 50 mM, pH 7,4, durante 1 hora com agitação em vórtex intermitente. </li><li> Após a lise das células, de centrifugação (10.000 xg, 20 min), ter sobrenadante e transferir para um tubo novo. Nota: Neste ponto, a quantificação de proteína pode ser realizada. </li></ol> 6. Disulfide bond Redução e alquilação <ol><li> Adicionar DTT 10 mM como uma concentração final de proteínas de lisados, vortex e incubar à TA durante 30 min. </li><li> Adicionar 50 mM idodoacetamide como uma concentração final de lisado, vortex e incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. </li></ol> 7. Precipitação <ol><li> Metanol clorofórmio precipitar a amostra por adição de 1 volume de lisado (400 ul como um exemplo), adicionar um volume (400 ul) de metanol e 0,5 volumes (200 mL) de clorofórmio. </li><li> Vortex da amostra e rotação (10.000 xg, 2 min). </li><li> Note-se que duas fases aparece depois da centrifugação. Descarte todos mas 2 mm da camada superior (tomando cuidado para não perturbar a interface). </li><li> Adicionar 1 volume (400 ul) de metanol, tubo invertido 1-2X suavemente para misturar e novamente girar (10.000 xg, 15 min). Elimine o sobrenadante para o lixo e ar pellet seco para 3-4 min. </li></ol> 8. A digestão com tripsina <ol><li> Reconstituir tripsina em 25 mM de bicarbonato de amónio contendo ureia 1 M a uma proporção de 50: 1 (W / W; proteína: tripsina) e incubadas overnight a 37 ° C, de preferência a 700 rpm num termomisturador. </li><li> Rotação (10.000 xg, 15 min) para sedimentar o material não digerido. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. </li></ol> 9. fosfopéptido Enriquecimento <ol><li> Realizar purificação e do enriquecimento de fosfopéptidos da digestão tríptica como previamente descrito 18. Diluir péptidos trípticos 10 vezes em tampão de DHB [tampão DHB consiste de: 350 mg / ml de ácido 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v), ACN (acetonitrilo), 2% (v / v) de TFA (trifluoroacético ácido)], e aplicam-se a secar o TiO 2 esferas (200 ug). </li><li> Deixar num rotor a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar a amostra com tampão DHB, girar e remover o sobrenadante. Em seguida, lava-se a amostra três vezes com tampão de lavagem [80% de ACN (v / v), TFA a 2% (v / v)] para remover o DHB. </li><li> Após a centrifugação final, eluir directamente os fosfopéptidos utilizando tampão de eluição por adição de 25 ul de um hidróxido de amónio a 2,5%, pH 10,5 ≥ solução. Sprender e remover o sobrenadante. Imediatamente ~ neutralizar com ácido fórmico a 0,3 ul. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Os passos críticos para uma análise proteómica bem sucedida e reprodutível de espermatozóides são: 1) pureza do material de partida; 2) a remoção de sais não desejados e detergentes; 3) desnaturação de proteínas toda a sua extensão de modo a permitir que a tripsina para digerir um elevado rendimento de proteínas e 4) minimizando o manuseamento da amostra para reduzir a perda de péptido. A fim de backflush cauda do epidídimo com sucesso, é essencial para localizar a área da qual os espermatozóides vai sair. No caso de ambos os ratos e ratinhos, isto é, no vértice da superfície côncava, no meio da região caudal do epidídimo (ver Figura 2A). Se alguém vem mais para o canal deferente, backflushing é mais fácil e a taxa de sucesso é geralmente mais elevada. No entanto, isso vem com a perda do número de espermatozóides. Em alternativa, se se tenta mover-se mais próximo do corpo, então a quantidade de pressão necessária para empurrar o espermatozóides de volta através do epididymdutos de AL é muitas vezes tão alto, que os danos para o epidídimo inevitavelmente ocorre. Backflushing do epidídimo é tradicionalmente realizado utilizando água saturada com óleo mineral e uma solução salina equilibrada na própria seringa, assim como um meio para remover os espermatozóides 22-25. Ambos os procedimentos são potencialmente problemática da LC-MS. Em primeiro lugar, mineral é susceptível de bloquear os nano-nano-C18 colunas que são basicamente utilizadas em todo o mundo para a análise proteômica e os cuidados devem ser tomados para que nenhum é transportado no procedimento. Se isto ocorre, é impossível continuar e a amostra é essencialmente perdido. Isto pode ser ultrapassado através da utilização de BWW ou outras soluções salinas equilibradas na seringa, no entanto, embora este seja bem sucedido, é reconhecido logo que muitos dos espermatozóides móveis se tornar tão logo a solução BWW entrou em contacto e misturado com o caudal do epidídimo células. Para contornar esse problema, simplesmente backflush dos espermatozóides com o ar. Não é só a quadade de espermatozóides comparável à dos métodos à base de líquidos, mas a quantidade é idêntica. Phosphoproteomics é talvez uma das únicas maneiras de estabelecer vias de sinalização que estão ocorrendo em espermatozóides pós-ejaculação. Uma das principais vias que estamos a investigar é o processo de capacitação. Espermatozóides deve sofrer &quot;capacitação&quot; antes que seja capaz de se ligar a um ovo. Na prática, isto é conseguido, basicamente, por incubação de espermatozóides durante um período de tempo (40 min ratinho; de rato de 1,5 h; 3-24 h humana) numa solução de albumina de soro com BWW. Anteriormente, nós e outros têm demonstrado um papel para várias quinases envolvidas na capacitação. De interesse, a exclusão da PKA μ II produzir camundongos cujos espermatozóides nadam de forma espontânea in vitro, mas não podem ser submetidos a hiperativação 26. O último é uma marca registrada de capacitação, em que os espermatozóides alterar o seu padrão de natação a partir de uma velocidade elevada, de baixa amplitude, com um baixovelocidade, amplitude alta frequência de batimento. Nós mostramos quinases a jusante envolvidos neste processo incluem pp60-CRV (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. Curiosamente, a inibição de SRC pára-dependente capacitação fosforilação da tirosina 13. No entanto, isso pode ser superado com o ácido ocadaico, sugerindo que SRC não está directamente envolvido no aparecimento geral de fosforilação da tirosina 29, mas podem regular uma fosfatase 29. O problema com o uso BWW como um meio para forçar espermatozóides fora do epidídimo é que uma vez ativado, espermatozóides mouse apenas levar cerca de 40 min para capacitar. Dado que o isolamento de espermatozóides pode levar de 5 min / rato e frequentemente vários ratos são usados ​​em uma experiência, em seguida, os espermatozóides será em diferentes fases de maturidade no início da experiência. Para ultrapassar esta situação, a pressão de ar pode ser usado para empurrar o espermatozóides do epidídimo caudal em uma cânula de vidro. Não só são todos inact espermaive e essencialmente como eles seriam encontrados no meio caudal, isso faz com que seja possível comparar phosphoproteomics não-móveis e imóveis. Manuseamento da amostra para phosphoproteomics devem ser mantidos a um mínimo quando se comparam os espermatozóides em dois estados funcionais diferentes. A utilização de metanol clorofórmio sobre os outros métodos tradicionais de precipitação da proteína 1) reduz a necessidade de passos de lavagem adicionais, 2) remove quase todos os vestígios de sais e gorduras e 3) tem uma capacidade comprovada para precipitar as proteínas de baixa abundância ao longo TCA 19. Precipitação de proteína antes da digestão com tripsina é recomendado uma vez que isto não só ajuda a desnaturar proteínas (o qual auxilia a digestão de tripsina), mas remove muitos dos metabolitos MS-incompatíveis presentes na célula. A comparação de fosfopéptidos de esperma pode ser feito de um número de maneiras. No nível básico, uma simples comparação do fosfopéptido identificada em uma amostra, para que, em outroamostra no processo conhecido como &quot;contagem espectral&quot; pode ser feito. No entanto crítica tem sido a esta abordagem, basicamente, porque os estudos de proteômica primeiros estavam usando baixas repetições (para uma discussão mais completa ver Lundren et al. 30). Uma abordagem mais sofisticada é olhar para a intensidade da massa pai peptídeo e comparar com as outras amostras (comparação livre-label). No exemplo mostrado na Figura 4, um péptido ausente do de não-móveis (Figura 4 em cima), mas presente no móveis (Figura 4 inferior) espermatozóides de m / z 650-670 pode ser visto. Este processo, designado por etiqueta baseada em MS quantificação livre é uma estratégia livre de marcador. Uma estratégia alternativa utilizada para reduzir a quantidade de funcionamentos necessárias para quantificação proteómica é o uso de isótopos. À medida que a massa de um isótopo é diferente, no espectrómetro de massa pode ser utilizado para comparar as intensidades da eluting péptidos. No entanto, diferentemente da maioria dos outros tipos de células, algumas marcação isotópica não pode ser aplicada aos espermatozóides. Por exemplo, a adição de isótopos estáveis ​​(um isótopo pesado é adicionado a uma amostra, ao passo que uma versão mais leve é ​​adicionado ao outro) podem ser utilizados em cultura de tecidos. Quando os isótopos são incorporadas na proteína, uma análise proteómica pode ser realizado através da combinação das duas amostras (multiplexação). No entanto, no caso de espermatozóides, isto não pode ser feito, simplesmente em virtude do facto de que 1) marcação isotópica requer várias passagens (até 8) em cultura de tecidos e 2) as células de esperma tem nenhuma transcrição do gene nuclear e tradução e, portanto, eles não podem incorporar os isótopos em todas as suas proteínas de qualquer maneira. Uma maneira de contornar isso é pedir camundongos radiofármacos, no entanto, estes são notoriamente caros. Uma abordagem alternativa é a utilização de uma etiqueta química. Isto foi feito quando os ratos não-capacitada foram comparados com ratinhos capacitadas. Neste caso, um e um D 0 D <sub&gt; 3 -label foi usada para distinguir entre uma amostra e um outro no espectrómetro de massa 31. Outras abordagens podem incluir o uso de iTRAQ (tag isobárica para a quantificação relativa e absoluta), em que as lisinas são rotulados quimicamente com diferentes isótopos de massa; iCAT (isótopo codificada marca de afinidade), pelo que cisteínas são marcados com diferentes isótopos de massa e rotulagem de água pesada e leve. Em cada caso, no entanto, uma coisa que precisa de ser mantido em mente. O MS apenas relata o que está presente em uma amostra, e isso é um reflexo de tudo o que aconteceu para que a amostra até esse ponto. Minimizando o manuseamento da amostra enquanto maximiza o rendimento em cada passo é necessário para uma análise proteómica bem sucedida.

Tendo emergido dos testículos, os espermatozóides são muito diferenciados ainda notavelmente, estas células são imaturas 1,2. Como tal, eles não têm a funcionalidade completa, incluindo a capacidade de nadar e se ligam a um ovócito 3. Embora seja necessário continuar a maturação do espermatozóide, isso não pode ocorrer por vias canônicas, uma vez que, nesta fase do seu processo de diferenciação celular, eles são incapazes de transcrição do gene e proteína mais biossíntese 4. Competência Biológica é conferido a espermatozóides como eles deixam o testículo e digite uma parte do sistema reprodutor masculino, conhecido como o epidídimo 5. O epidídimo é um tubo em espiral apertado, altamente diferenciado, que liga as condutas de eferentes (de testículos) para os canais deferentes e está presente em todos os mamíferos do sexo masculino 6. Espermatozóides adquirir progressivamente o seu potencial fertilizante durante a descida do epidídimo, contando com o ambiente luminal em constante mudança que é created pelas células epiteliais do epidídimo locais 7. As diversas atividades secretoras e re-absorção presentes no ato epididymal meio para modificar o próprio esperma, alterando a sua proteína, carboidratos e lipídeos composição 6. A importância do epidídimo, particularmente a região inicial &#39;caput&#39; dessa estrutura tenha sido exemplificada utilizando técnicas de ligação 8 cirúrgicos. Espermatozóides retida dentro do testículo por ligadura de ducto eferente são completamente desprovido de qualquer capacidade de fertilizar o óvulo 9-11. Além do ambiente epididimal, vias de transdução de sinal dentro do trabalho de espermatozóides ao pós-traducionalmente modificar o complemento existente de células de esperma. Por exemplo, os espermatozóides a partir do início regiões do epidídimo exibir diferentes padrões de fosforilação de proteínas em comparação com estas últimas regiões 5,12. Isto não é surpreendente uma vez que existem grandes diferenças na capability do esperma destas regiões. Por exemplo, os espermatozóides do início, caput epidídimo são immotilite. Em contraste, as células do esperma da região da cauda para a frente serão submetidos a motilidade progressiva, uma vez colocados em meio isotónico. Como as células de esperma do epidídimo são incapazes de biossíntese de proteínas-novo, todas as vias intrínseca que regulam a função do esperma deve ser através de modificações pós-traducionais (PTM). Por isso, é lógico que proteômica e, nomeadamente, a investigação de PTMs como fosforilação deve ser um grande impulso para que possamos conhecer a maturação do espermatozóide. Um método alternativo para a obtenção dos espermatozóides epididymidies usar retro-backflushing 13-16. Embora esta técnica é, certamente, mais demorada e tem um maior grau de habilidade por parte do operador, os espermatozóides obtidos demonstram de forma consistente pureza superior a 99,99%. Além disso, ao contrário de todas as outras técnicas, ca espermatozóidesn ser isolada num estado de repouso, tornando-se possível estudar a motilidade do esperma como é iniciada. Como preparação da amostra é o aspecto mais importante para a análise proteômica, isolamento de espermatozóides tornou-se um dos aspectos mais importantes de estudos de esperma-proteômica. Este protocolo proporciona uma explicação de como os espermatozóides são isolados a partir de cauda do epidídimo. Após isto, o processo de enriquecimento de TiO 2 fosfopéptido é descrito, com referência específica sobre como extrair péptidos a partir das células de esperma altamente diferenciadas. A abordagem MS pode ser usado para distinguir mudança fosfopeptídeos se fosse para comparar os espermatozóides do epidídimo caudal em um estado (immotile ou não capacitados) para outro (móveis, capacitados, acrossoma reagido, etc.) tornando-a uma abordagem poderosa para estudar esperma função.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

Os espermatozóides são bastante único entre os tipos de células. Embora produzido no testículo, tanto a transcrição do gene nuclear e tradução são desligadas uma vez que a célula rodada pré-cursor começa a se alongar e se diferenciar em que é morfologicamente reconhecida como um espermatozóide. No entanto, o espermatozóide é muito imaturo, não tendo capacidade para motilidade ou reconhecimento de ovo. Ambos os eventos ocorrem uma vez que o trânsito espermatozóides um órgão secundário conhecido como o epidídimo. Durante a passagem ~ 12 dias que demora para uma célula de esperma de passar através do epidídimo, modificações pós-traducionais das proteínas existentes desempenham um papel crucial na maturação da célula. Uma faceta importante de tal proteína é a fosforilação. A fim de caracterizar eventos de fosforilação que ocorrem durante a maturação do esperma, é necessário estabelecer as duas populações de células de esperma puros e pré-fracionamento de fosfopeptídeos. Usando técnicas de descarga de volta, um método para o isolamento do puro espermatozóides of alta qualidade e rendimento dos epidídimos distais ou caudal é delineada. Os passos para a solubilização, a digestão, e pré-fraccionamento de fosfopéptidos de esperma por meio de cromatografia de afinidade de TiO 2 são explicadas. Uma vez isolado, fosfopéptidos pode ser injectado na MS para identificar os dois eventos de fosforilação de proteína sobre os resíduos de aminoácidos específicos e quantificar os níveis de fosforilação que ocorre durante os processos de maturação do esperma.

A qualidade dos resultados de qualquer análise proteômica é fortemente dependente do material de partida. Com MS modernos, leves contaminações em preparações de amostra são facilmente apanhados. Portanto, é essencial, no caso de células de esperma proteómica, para escolher um método que dá espermatozóides altamente puro. Como ilustrado na Figura 1, backflushing retrógrada é usado para recuperar células de esperma de cauda do epidídimo. Trata-se de canulação dos vasos deferentes com tubagem PE que permite aplicar lentamente a pressão de ar da seringa em anexo. Figura 1A demonstra cauda do epidídimo, juntamente com os canais deferentes. Figura 1B é um fim acima do tiro de como o canal deferente é ligada em que o é inserida uma cânula. Ao fazer, por isso, os espermatozóides são liberados no final extirpado de um túbulo dos epidídimos caudais. Como mostrado na Figura 2A, os espermatozóides são extraídos a partir das regiões apicais do CAUDum epidídimo e são sugados para dentro de um capilar de vidro em um estado de repouso (Figura 2B). Isto tem várias vantagens sobre os métodos tradicionais &quot;nadar-up&quot;, não o menos importante dos quais é a capacidade de realizar uma análise phoshoproteomic dos espermatozóides antes e depois da activação da motilidade. Os espermatozóides podem então ser expelido para a mídia de sua escolha. Figura 2C (lado esquerdo) demonstra como o esperma procurar imediatamente após expulsão em media BWW. Muitas das células são aglutinados. No entanto, após 10 min da competência das células é demonstrada porque nadar para homogeneidade na solução (Figura 2C, células à direita). Uma vez que a técnica backflushing tem muito pouco impacto sobre as células do esperma, obtém-se perto de 100% e a motilidade das células dispersam-se rapidamente para o meio externo sem provocação. Em um experimento backflushing típico, esperma recuperado da Swiss-rato contémentre 1-5 x 10 6 células. Isto é altamente dependente da idade do animal, e pode variar entre diferentes estirpes de ratinhos. Em um rato da Noruega, que tipicamente se obter 200 x 10 6 espermatozóides, ± 20%. A Figura 2D representa o grau de pureza obtido a partir de espermatozóides cauda do epidídimo de rato. Além da própria amostra, uma das principais questões relacionadas com a preparação da amostra é o rendimento da digestão de tripsina. Precipitação de proteínas desempenha um papel importante, não apenas na remoção de detergentes e sais indesejados, ambos os quais são incompatíveis com MS, mas também em desnaturação de proteínas. Nós descobrimos que o precipitação metanolclorofórmio funcionar melhor. Não apenas esse procedimento foi relatado para precipitar proteínas abundantes baixas melhor do que outros, incluindo TCA precipitação 19, mas tem vantagens adicionais. Após precipitação com TCA, é muitas vezes necessário reajustar o pH após a suspensão da pelota ACT, que pode permanecer bastanteácida. Embora o sedimento precipitado de TCA pode ser lavado em soluções orgânicas elevadas para remover o ácido, o que aumenta o manuseamento da amostra e irreproducibility de resultados. A falha em neutralizar o ácido vai resultar em baixos rendimentos de péptidos trípticos. Precipitação de metanol-clorofórmio é não só rápido, mas não se acidificar a amostra. A Figura 3 ilustra o sedimento de proteína tipicamente visto a partir de 100 mg de amostra a interfase entre inferior e superior. O isolamento dos fosfopéptidos pode ocorrer em um número de maneiras; no entanto reprodutibilidade depende de como a amostra ter sido tratada até e incluindo esta etapa. Um dos métodos em desenvolvimento, mais comuns é TiO 2, originalmente desenvolvido pelo grupo de Martin Larsen 18,20,21. Embora tenha sido descrito como um processo para usar em microcolunas, podemos obter dados reprodutíveis usando cromatografia em lotes. O sucesso do processo é fortemente dependente do tampão de eluição, que deve estar louco<html> e com a composição correta; caso contrário, não são eluídas fosfopéptidos em tudo. A reprodutibilidade dos dados do protocolo e representativos de TiO2 a partir da cauda do epidídimo fosfopéptidos esperma enriquecido em um não-móveis (Figura 4 em cima) e móveis (Figura 4 inferior) estado de m / z 650-670 pode ser visto. Nós demonstramos que esta é uma técnica extremamente reprodutível mesmo quando se usa repetições biológica 17. As estrias azul aparecem ao longo do tempo são péptidos que eluem a partir de um nano-coluna C18 como a concentração de acetonitrilo aumenta. Claramente, a população em móveis (n = 3 ilustrados, n = 8 funcionam tipicamente), há um peptídeo de grupo, com uma massa monoisotópica torno da faixa de 651,5 Da que está completamente ausente no intervalo não-móveis. Espectrometria de massa em tandem é então utilizado para identificar este péptido. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Canulação da cauda do epidídimo (A) Imagem da cauda do epidídimo. A própria cânula é gravada para baixo para expor aproximadamente 1-2 cm da extremidade pré-puxado. Este é inserido nos vasos deferentes usando finas # 5watchmakers fórceps. (B) A cânula é mantida no lugar por amarrar seda fina em torno de um segmento que contém ambos os canais deferentes e da cânula. A partir do ratinho, aproximadamente 2-3 ul de células do epidídimo e caudais de fluido são recolhidos a uma concentração de 1 x 10 6 / mL. A partir do rato (mostrado), cerca de 30-40 uL de fluido são obtidos em concentrações semelhantes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figura 2: capilar de vidro usado para coletar espermatozóides do epidídimo competente. (A) Um túbulo do ápice da cauda e<html> pididymis é isolado e quebrado. A posição aproximada do qual isto ocorre é mostrado. (B) A parte superior da imagem mostra um tubo capilar de vidro vazia e a parte inferior apresenta uma a partir de um rato previamente backflushed. Não há contaminação sanguínea e contaminação de células epiteliais mínima. (C) Como os espermatozóides são ainda diluído no líquido do epidídimo, eles não começaram a ativar. Quando os espermatozóides são inicialmente expulsos em uma solução BWW, eles vêm como uma &quot;string&quot; compacto (lado esquerdo). A competência da célula é facilmente estabelecida, uma vez que depois de 10 min mais dos espermatozóides nadam em solução, sem qualquer perturbação externa (lado direito). (D) Uma imagem de uma alíquota de células do epidídimo caudais imediatamente depois de terem sido deixados para nadar fora demonstra a pureza das células. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3:. Precipitação de metanol-clorofórmio Uma vez que os espermatozóides foram solubilizados, a fracção solúvel é precipitado de metanol-clorofórmio para assegurar a desnaturação das proteínas e a remoção de substâncias contaminantes. O sedimento de proteína aparece na interface entre as fases de metanol / água e clorofórmio. A camada superior é removido com cuidado, de modo a não perturbar este pellet. É comum para deixar cerca de 2-3 mm da fase superior, de modo nenhum se perde proteína. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Típica TiO2 perfil fosfopéptido enriquecido Utilizando o protocolo descrito, caudal espermatozóides epididimal foram isolados em qualquer immotile (topo, N = 3) ou estados com motilidade (inferior, N = 3). Um cluster de peptídeo com uma massa mono-isotópica do ~ 651,5 Dum é mostrado para estar presente nas populações com motilidade mas completamente ausente em os immotile (seta). Comparações desta natureza são referidos como &quot;livre de marcador (baseado em MS)&quot;. A massa do péptido e o tempo de retenção são então utilizadas para direccionar o composto para espectrometria de massa em tandem e identificar a proteína a partir dos quais o péptido foi derivado.

Watch this Scientific Journal Video about Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa at JoVE.com

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Fosfopéptido Análise de Rodent epidídimo Espermatozóides

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K visualizações.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Vídeo: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Princípios de Cirurgia de roedores para o Cirurgião Nova

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Expressão Transgênica Viral em Corações de Roedores e Avaliação do Risco de Arritmia Cardíaca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...