Os autores gostariam de agradecer Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) e Nathaniel Snyder (Universidade da Pensilvânia) pelas valiosas discussões sobre calibração de massa e processamento de dados. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número R00CA168997. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

1. Preparação de LC-MS Reagentes, Estabelecimento de um método de cromatografia, e estabelecimento de procedimentos operacionais de instrumentos <ol><li> Preparação de solventes LC <ol><li> Prepare 500 ml fases móveis. A é acetato de amónio 20 mM e 15 mM de hidróxido de amónio em 3% de acetonitrilo / água, pH final de 9,0; e B é 100% de acetonitrilo. </li><li> Vagamente tampar a garrafa, coloque-o em um banho de água sonicador e sonicate por 10 minutos sem aquecimento extra. (Este passo é o de assegurar que todos os sais de amónio e dissolver completamente que não há bolhas de ar residual.) </li><li> Transferir 250 ml de solvente a uma garrafa de 250 ml de vidro para uso LC-MS, e manter o restante a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare a solução de calibração gama baixa massa. É importante a utilização de uma mistura de calibração de gama baixa massa personalizado para aplicações metabolómicos para assegurar que as massas exactas são detectados com pesos moleculares baixos. <ol><li> Pesar 5 mg de ambos Sodihum fluoroacetato e ácido homovanilico e dissolvê-los em 5 ml de água para fazer uma concentração final de 1 mg / ml. Dissolver em metanol diazinon para fazer uma concentração final de 10 mg / ml. </li><li> Para preparar 1 ml de solução negativa baixa calibragem massa, misture 960 ml de solução de calibração térmica negativa com 20 ml de fluoroaceate sódio e solução de ácido homovanílico. Para fazer com que 1 ml de solução positiva baixa calibragem massa, misture 990 ml de solução de calibração termo positivo e 10 ml de solução diazinon. (A solução de calibração de baixa massa deve ser armazenada a 4 ° C e ser preparado fresco a cada 2 meses.) </li></ol></li><li> Calibração de QE-MS em uma missa Gama Baixa <ol><li> Antes de realizar a calibração de baixa faixa de massa, efectuar uma calibração de massa padrão (m / z, 150-2,000) nos modos positivos e negativos com base em instruções do fabricante. </li><li> Uma vez que uma massa de calibração normal passa, ajustar o intervalo de varredura de 60-900 m / z no painel de controle do instrumentoe uma fonte de CID de 25 eV no modo positivo e de 35 eV no modo negativo é aplicado. (Isto dará sinais consistentes de ião fragmento cafeína e o ião sulfato. O intervalo de varrimento aqui é fixo, porque a última m / z não deve ser maior do que a 15x da partida m / z) </li><li> Uma vez que a fonte de íons é estável, em seguida, realize a calibragem personalizado. Nota: Uma fonte estável é definida como inferior a 10% da variação de corrente total de iões no modo positivo, e menos do que 15% em modo negativo. Os iões de calibração correspondendo à medida e m / z são indicados na Tabela 1. </li></ol></li><li> Estabelecer a instrumentação LC-MS para análise metabólito polar. LC é acoplado a um QE-MS para separação e detecção de metabolito. <ol><li> Equipar o QE-MS com uma sonda de ionização electrospray aquecida (H-ESI). Defina os parâmetros de ajuste relevantes para a sonda, conforme listado: temperatura do aquecedor, 120 ° C; gás bainha, 30; gás auxiliar, 10; varrer a gás, 3; pulverizar tensão, 3,6 kV paramodo positivo e 2,5 kV para o modo negativo. Ajuste da temperatura de capilar a 320 ° C, e S-lente a 55. </li><li> Construir um método de varredura completa da seguinte forma: faixa de varredura completa: 60 a 900 (m / z); resolução: 70.000; tempo máximo de injeção: 200 ms com tempos típicos de injeção de cerca de 50 ms; controle automático de ganho (AGC): 3.000.000 íons. Essas configurações resultar em um ciclo de trabalho de cerca de 550 ms para a realização de exames em modo positivo e negativo. </li><li> Estabelecer o método de cromatografia. Empregar uma coluna de amida (100 x 2.1 mm id, 3.5 mm) para separação de compostos à temperatura ambiente 13,15. A fase móvel A é como descrito acima, e a fase móvel B é acetonitrilo. Usar um gradiente linear como se segue: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B e 20 minutos, 85% de B. O caudal é de 0,15 ml / minuto, desde 0 até 10 minutos e 15 a 20 min, e 0,3 ml / min, 10,5-14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparation de Amostras metabólito <ol><li> Preparar um solvente de extracção. Misturar 40 ml de metanol (LC-MS grau) e 10 ml de água (LC-MS grau) em um tubo de 50 ml, e mantê-lo no freezer -80 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização. Nota: O procedimento e os passos que se seguem podem ser modificadas para a extracção do tecido biológico e amostras de fluidos. <ol><li> HCT cancro do cólon 8 Cultura de células em três placas de 10 cm ou de placas de 6 poços, com meio de crescimento completo, meio RPMI 1640 suplementado com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino e 100.000 unidades / L de penicilina e 100 mg / L de estreptomicina. </li><li> Quando as células chegar a 80% de confluência, remover rapidamente o meio e coloque o prato ou prato em cima de 13,15 gelo seco. Adicionar 1 ml de solvente de extracção imediatamente (80% de metanol / água), e transferir a placa para a -80 ° C congelador. Para uma placa de 10 cm, adicionar 3 ml de solvente de extracção para cada poço. (Tentar remover o meio, tanto quanto possível, para evitar o efeito de supressão de iões devido aos sais residuais do meio.)</li><li> Deixar a placa durante 15 min. Retire-o do freezer, e raspar as células para o solvente em gelo seco. Transferir a solução de 1,7 ml de Eppendorf e centrifuga com a velocidade de 20.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabólitos celulares a partir de três pratos separados para fazer três amostras idênticas. A finalidade de manter dois tubos é ter um como um backup.) </li><li> Transferir o sobrenadante para dois novos tubos Eppendorf, e secá-las sob vácuo velocidade. Isto leva cerca de 3-6 horas, dependendo da velocidade de vácuo utilizado. (As amostras também podem ser secas durante a noite sob atmosfera de azoto.) </li><li> Após a secagem, armazenamento de tubos de cada amostra no freezer -80 ° C. Quando pronto, reconstituir uma amostra em 20 ml de água (LC-MS grau), e injectar 5 ml de LC-QE-MS para análise. </li></ol></li></ol> 3. Configuração de Sequência Amostra <ol><li> Uma vez que a calibração foi corretamente realizado na QE-MS, equilibrar coluna LC por 5 min com 85% de A a um fluxotaxa de 0,15 ml / min, o que é a condição inicial do gradiente LC. </li><li> Configure a seqüência de amostra, de forma aleatória. Nota: Neste modo, que distribui as flutuações introduzidas por LC-MS para cada amostra e garante comparação mais precisa entre as diferentes amostras. Cada 6 amostras, adicionar uma corrida de lavagem, o qual partilha o mesmo método de MS, excepto o gradiente de LC é de 95% de A durante 10 min e seguido de uma coluna de equilíbrio de 5 minutos a 85% A com uma taxa de fluxo de 0,15 ml / min. Adicionar amostras em branco (100% de água) após cada corrida lavagem para avaliar o ambiente do sistema e transitar níveis. </li><li> Salve a sequência e uma vez que a coluna LC mostra a pressão estável, em torno de 400 psi, iniciar a seqüência de execução. Se não há outro exemplo é para ser executado após esta sequência, em seguida, adicionar uma corrida de paragem no fim da sequência, que tem uma taxa de fluxo de 0 ml / min, no fim do gradiente e escolha de &quot;espera&quot;, após terminar a seqüência. </li><li> Re-executar a mesma amostra definida 12 horas após a calibração. (Esta is para avaliar a variação de massa de erro após a calibração.) </li></ol> 4. Publicar Análise Instrumento de Limpeza e Manutenção <ol><li> No final da sequência, lava-se a coluna com 95% de A a uma taxa de fluxo de 0,2 ml / min, durante 2 horas, e, se necessário, inverter a coluna antes da lavagem. </li><li> Remova a coluna LC e se conectar diretamente a LC à fonte de íons por um sindicato. Preparar um solvente de limpeza, / metanol / ácido fórmico água (v: v: v, 90:10:0.2), definido de MS em modo de repouso, e um sistema de lavagem de LC-MS, a uma taxa de fluxo de 0,1 ml / min durante 1 hora para remover o precipitado residual sais ou outras impurezas. Abaixe a taxa de fluxo, se houver pressão do sistema muito. </li><li> Ajuste da temperatura de capilar a 50 ° C, e retirar a gaiola de iões. Retire cuidadosamente o cone de varredura de íons e do tubo de transferência de íons após a temperatura capilar cai para 50 ° C. Use uma malha grosseira, tal como lixa, para remover as impurezas deixadas sobre a superfície do cone de varrimento de iões. </li><li> Coloque a transferência de iõestubo dentro de um tubo Falcon de 15 ml contendo 10 ml de água 90% / metanol com ácido fórmico a 0,1%. Depois de sonicação o tubo num banho de água de ultra-sons durante 20 minutos, decanta-se o solvente no interior, substituí-la com 10 ml de metanol puro e sonicar durante mais 20 minutos. (Se necessário, a sonicação pode ser feito a 40 ° C ou mesmo uma temperatura mais elevada para obter melhores resultados de limpeza.) </li></ol> 5. Análise de LC-MS de Dados <ol><li> Para garantir a seqüência de amostra é executado sem problemas, depois de terminar as duas primeiras amostras na seqüência, verificar picos de metabolitos desconhecidos. Use um arquivo csv listando nomes metabólito, fórmula química neutra e modo de detecção (positivo ou negativo), como o arquivo de entrada eo arquivo de saída contém picos extraídos e erro em massa em ppm. Se a forma do pico é anormal ou o erro de massa é desligado por mais do que 5 ppm, em seguida, o resto da sequência deve ser parado e solução tem de ser feito. </li><li> Escolha o método de &quot;alinhamento de picoe extração frame &quot;em software disponível comercialmente. Selecione os dados brutos de LC-MS e agrupá-los. Escolha amostras no meio da seqüência de execução como amostra de referência de cromatografia para o alinhamento de pico. Envie uma semente quadro incluindo metabólitos conhecidos para a análise metabólitos alvejado com dados coletados e as sementes quadro correspondente. </li><li> Realizar análise de dados em modo positivo e negativo separadamente. Use a configuração padrão para outros parâmetros. Desligue a função de pesquisa de banco de dados e executar o fluxo de trabalho. Exportar os dados processados ​​como uma folha de excel, contendo a área do pico de cada frame. Os primeiros conjuntos de quadros correspondem aos metabolitos na lista alvo. Nota: Para uma análise metabolito alvo, a informação metabolitos é obtido com base nos estudos anteriores 13,15. </li><li> Para uma análise metabólito não segmentados, escolha o método de &quot;extração de componente&quot;. Carregar amostras em branco para o fundo subtração. Definir pico intensidade do limiar de umt 10 5, a largura m / z de 10 ppm e a relação sinal-ruído de 3. </li><li> Utilizar dados metaboloma humano para a identificação de compostos desconhecidos. Use um filtro de CV para remover os componentes com grandes currículos dentro de amostras idênticas. Ir manualmente através de cada componente e escolher aqueles com pico bem definido ou relativamente grande diferença em amostras de diferentes tipos de pesquisa de banco de dados. Exportar dados com acessos em banco de dados. (Alinhamento Peak pode ser contornado se a pontuação alinhamento de pico é muito baixa.) </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e...

Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de 1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos 5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como 13 C metabolitos marcados, são RMN-activo 10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau de pureza da amostra e grande quantidade de amostra, o que limita as suas aplicações em metabolômica. Enquanto isso, os dados recolhidos a partir de RMN precisa de análise intensiva e atribuição composto de espectros de RMN complexo é difícil. GC-MS tem sido amplamente utilizada para os metabolitos polares e estudos de lípidos, mas requer os composto volátilds e, portanto, muitas vezes derivação de metabólitos, o que às vezes envolve química complexa que pode ser demorado e introduz ruído experimental. Cromatografia líquida (LC) acoplada à espectrometria de massa triplo quadrupolo utiliza o primeiro quadrupolo para selecionar os íons pais intactos, que são fragmentados no segundo quadrupolo, enquanto o terceiro quadrupolo é usado para selecionar fragmentos característicos ou íons filha. Este método, que registra a passagem de íons de pais para filha íons específicos, é denominado de monitoramento de reações múltiplas (MRM). MRM é um método muito sensível, específico e robusto tanto para pequenas moléculas e quantificação de proteínas 12-15,21. No entanto, MRM tem suas limitações. Para alcançar alta especificidade um método MRM precisa ser construído para cada metabólito. Este método consiste na identificação de um fragmento específico de energia de colisão e optimizado, o que requer conhecimento prévio do prope correspondentesrties dos metabólitos de interesse, tais como informações de estrutura química. Portanto, com algumas excepções que envolvem a perda neutra de fragmentos comuns, não é possível identificar metabolitos desconhecidos com este método. Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) instrumentos foram lançados, como a série LTQ-Orbitrap e Exactive, o QuanTof e TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS pode proporcionar um rácio de massa para carga (m / z) de iões intactas dentro de um erro de poucos ppm. Portanto, um instrumento HRMS operado pela detecção de todos os iões de precursor (ou seja, modo de varrimento completo) pode obter informação estrutural directa da massa exacta e a composição elementar resultante da substância a analisar, e esta informação pode ser usada para identificar possíveis metabolitos. Com efeito, todas as informações sobre um composto pode ser obtido com uma massa exacta, até o nível de isómeros estruturais. Além disso, um completométodo de verificação não requer conhecimento prévio de metabólitos e não requer método de otimização. Além disso, uma vez que todos os íons com m / z cair na faixa de varredura pode ser analisado, HRMS tem uma capacidade quase ilimitada em termos de número de metabólitos que podem ser quantificados em uma única corrida em comparação com o método MRM. HRMS é também comparável ao de um MRM quadrupolo triplo da capacidade quantitativa devido ao ciclo de trabalho curto, resultando num número comparável de pontos de dados que podem ser obtidos de uma análise completa do MS. Portanto, HRMS proporciona uma abordagem alternativa para o metaboloma quantitativos. Recentemente, uma versão melhorada do HRMS denominada espectrometria de massa Q-Exactive (QE-MS) pode ser operado sob a comutação entre os modos positivos e negativos com tempos de ciclo suficientemente rápido em um único método, o que amplia o alcance de detecção 19. Aqui nós descrevemos a nossa estratégia metabolômica usando o QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.

A precisão dos dados metabolômica altamente depende do desempenho do instrumento LC-QE-MS. Para avaliar se o instrumento está a funcionar em boas condições, e se o método aplicado é adequado, vários picos LC metabolitos conhecidos são extraídos a partir da cromatografia iónica total de (TIC), como mostrado na Figura 1. Metabolitos polares, incluindo aminoácidos, intermediários glicólise , intermediários de TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADPH e assim por diante têm uma boa...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K visualizações.  Cornell University.  Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...