Agradecemos Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e todos os membros atuais e anteriores do laboratório de Berger para ajuda e conselhos. A plataforma MultiBac e seu desenvolvimento têm sido e são generosamente apoiados por agências de financiamento, incluindo a Swiss National Science Foundation (SNSF), a Agence National de Recherche (ANR) e do Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e da Comissão Europeia (CE) em programas-quadro (FP) 6 e 7. Apoio ao acesso transnacional é fornecido pelos projetos FP7 CE P-CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) e BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). O Ministério da Ciência é particularmente reconhecido por apoiar a plataforma MultiBac no EMBL através do Investissement d&#39;Avenir projeto Frisbi.

1. Tandem recombineering (TR) para a criação de MultiGene construções de expressão <ol><li> Planejando a estratégia de co-expressão. Abordagem de projeto para inserir seus genes de interesse em doadores e receptores. Submódulos fisiológicas potenciais de seu complexo devem ser agrupadas em Aceitantes e Doadores específicas. Use Module multiplicação composta por endonuclease Homing (HE) - pares BstXI combinar cassetes de expressão em doador individual e plasmídeos Acceptor 7,8 Criar todas as construções relevantes em silico e validar a estratégia cuidadosamente antes de prosseguir com o trabalho experimental.. Por exemplo, os genes de interesse deve ser verificado que não contêm HE ou outros locais de restrição e a presença de estruturas de leitura abertas (ORFs correctas) deve ser validado. Considere ordenação genes sintéticos otimizados para uso de códons célula de inseto e estrutura secundária do mRNA para melhorar os níveis de produção de proteínas, bem como a remoção de qualquer exipicar HE locais dos genes de interesse. Considere colocar etiquetas de purificação baseado em dados de literatura sobre N-ou flexíveis ou exposto C-Termini de suas proteínas de escolha. Considerar a aplicação de estratégias poliproteicos que visam a produção de várias subunidades da proteína em seu complexo se as quantidades relativas de proteínas individuais precisam ser controlados devido a problemas de estequiometria do complexo. 4 Prepare detalhado &quot;How-To&quot; documento (recomenda livro de laboratório eletrônico) contendo todas as etapas experimentais projetadas do projeto que levou à construção multigene completo (s). Criar arquivos eletrônicos dos Cre-LoxP plasmídeos fundidos, por exemplo, usando o software Cre-ACEMBLER que pode ser baixado a partir da home page do grupo Berger ( <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / cre-acembler</a> ). </li><li> Insira seus genes de interesse em doadores selecionados eAceitantes, usando enzimas de restrição e ligase, ou, alternativamente, por meio de ligação métodos independentes seguintes protocolos publicados 5,6,14. Se você tiver acesso a uma estação de trabalho de manipulação de líquidos e se você planeja um grande número de construções a serem gerados ( por exemplo, para abordagens combinatórias) considerar o uso de scripts de robótica desenvolvidos e implementados pelo grupo Berger (Figura 2). 14,15 Se uma estação de trabalho de manipulação de líquidos não estiver disponível, a operação manual utilizando microplacas permite a inserção de genes em um HT como a moda. </li><li> Restrições impostas pela necessidade de controlar a estequiometria das subunidades expressas pode materializar. No caso de níveis de expressão desequilibradas estequiometricamente de unidades individuais de um complexo de proteínas, considerar a aplicação de estratégias poliproteicos conjugar várias subunidades do seu complexo e uma protease específica (por exemplo, tabaco etch virus Nia protease) em grandes ORFs individuais espaçadas de sSites proteolíticas ESPECÍFICAS. 4,8 Considere co-expressando um ou vários poliproteinas com cassetes de expressão de solteiro, se você tem um grande complexo com várias subunidades e amplamente variando pesos moleculares das subunidades individuais. Considerar que co-expressam vários genes que codificam para a mesma proteína em uma poliproteína ou como várias cassetes de expressão idênticos se que a proteína é caracterizada por baixo rendimento de produção. 4,13 </li><li> Validar todos doador e receptor construções clonados por mapeamento de restrição (opcionalmente no high-throughput) e seqüenciamento. Prossiga para fundir combinações doador-aceitante por Cre-LoxP recombinação para gerar os multigênicas construções de expressão de escolha. Validar aceitador doador de plasmídeos de fusão purificou-se por mapeamento de restrição, utilizar sequências electrónicas criadas por Cre-ACEMBLER programas semelhantes ou como uma referência. </li><li> Guarde Doadores, aceitantes e fusões Donor-Acceptor purificados e validada a -20 ° C ou -80 ° C. Arquivo plasmids e suas seqüências (Microsoft Excel, FileMaker, outros) com cuidado para uso posterior. </li></ol> 2. MultiGene Composite Baculovirus Geração, amplificação e armazenamento <ol><li> Integrar os vetores de transferência multigênicas genoma baculoviral MultiBac por se transformar em células DH10 abrigar o genoma viral e as funcionalidades requeridas para Tn7 transposição. Note-se que o genoma de baculovírus Multibac pode ser pré-carregado com os genes particulares de interesse (YFP marcador, chaperones, etc) no seu próprio sítio loxP (engenharia no genoma distal ao sítio de ligação do Tn7) in vivo por uma reacção anterior Cre Tn7 integração. Após 13 Tn7 transposição, as células com baculovírus compósito contendo os genes de interesse são seleccionadas por rastreio azul / branco (Tn7 resultados bem sucedidos de transposição em perda de α-complementação do β-galactosidase e, portanto, as colónias com correcta Tn7 transposição permanecem brancas sobre um selectivaplacas de gar contendo X-gal) e o genoma é preparado por lise alcalina e etanol / precipitação com isopropanol 5,6. </li><li> A transfecção e produção de vírus inicial. Ponto de 6 poços na placa de cultura de tecido estéril capa. A partir da fase log da cultura de células de insecto Sf21, a semente alíquotas de células nos poços e transfecção por adição do genoma de baculovírus purificado e um reagente de transfecção misturados em meio de cultura, tal como descrito. 6 Colheita de vírus inicial após 48-60 horas, removendo os meios de comunicação ( de alta qualidade, de baixo título do vírus V 0, tipicamente de 3 ml por cavidade). Suplemento meios frescos e de ensaio para a produção de proteína (e, se um marcador YFP está presente, por fluorescência), após um período adicional de 2-3 dias 6,7. </li><li> Amplificação do vírus, baixa MOI regime. Usar V 0 vírus de infectar 25-50 ml de células em fase logarítmica (densidade celular &lt;1x10 6 células por ml) em pequenos (100-250 ml) agitador frascos Erlenmeyer agitadosem crivos de plataforma orbital (Figura 3). Contagem de células e dividi cada 24 horas até as células param de duplicação (proliferação de prisão). Seguir um regime de baixa MOI (multiplicidade de infecção ou seja, o número de partículas de vírus por célula): As células devem dobrar (pelo menos) uma vez (MOI &lt;1), caso contrário, repetir experimento com um menor volume de V 0 adicionado. Normalmente, 3 ml de 0 V são utilizados para infectar 25 ml de células de insecto Sf21, a uma densidade de 0.5x10 6 células / ml. Isto é essencial para evitar prejudicial sobre-amplificação e de auto-eliminação de vírus que pode resultar na perda dos genes heterólogos de interesse. Colheita V um vírus (25-50 ml), após 48-60 horas por peletização células e remover a mídia que contém o vírus. Suplemento com novas mídias e ensaio de YFP e produção de proteínas através da remoção de 1x10 6 células a cada 12 ou 24 horas, peletização e validar a produção de proteína e (YFP) sinal proteína marcadora. 6, Amplify vírus (paraV 2) mais se volumes maiores de expressão visam infectando-se às células 400 ml em 2 L shaker frascos com um vírus V respeitando acima baixa MOI regime (células deve dobrar pelo menos uma vez após a infecção com V 1). Rigorosamente testar a produção de proteína e proteína marcadora de sinal durante a amplificação para evitar o acúmulo de vírus defeituosos não contendo seus genes de interesse. 5-7 Uso pellets de células que se acumulam a cada amplificações passo já para o estabelecimento de protocolos de purificação para o complexo de proteína expressa de interesse. </li><li> Armazenamento BIIC produção de vírus. É altamente recomendável para armazenar V 2 do vírus como o vírus da produção usando o BIIC (B aculovirus-i i nfected nsect ells c) método para prevenir as modificações (por exemplo, a perda do gene de interesse) do vírus recombinante e para preservar a expressão elevada nívels 16 células infectadas pelota 24 horas após a prisão proliferação é observado -. Neste estágio as células contêm partículas virais completas antes que eles seriam libertados (por brotamento) nos meios de comunicação. Remova a mídia e alíquotas de congelar o pellet celular em nitrogênio líquido e armazenar indefinidamente. 7,16 </li></ol> 3. Produção de proteína e Processamento Downstream <ol><li> Infectando grandes culturas (r) e monitoramento YFP. Usar V 1, V 2 ou BIIC alíquotas congeladas para infectar culturas de células maiores para corridas de produção (tipicamente de 400 ml em frascos de 2 L). Aderir à baixa MOI regime (ajustar o volume do vírus utilizado para a infecção de modo que a cultura infectada duplica, pelo menos uma vez). Ampliar volumes de cultura infectados, se necessário, pela multiplicação do número de frascos. Se YFP proteína marcadora está presente, retirar-se em intervalos de 1x10 6 células definidas, granulada e lisar as células e monitorar a evolução do sinal YFP até um platô é atingido indicating máxima produção da proteína recombinante. Níveis de YFP pode ser medida num leitor de placa de 96 poços padrão capaz de gravar sinais de fluorescência (p. ex SPECTRAFluor Tecan). Células colheita nesta fase. Loja de pellets de células a -20 ° C (curto prazo) ou -80 ° C (longo prazo). </li><li> Lise celular e fracionamento. Lisar as células por seu método favorito de escolha, adaptado às necessidades de sua proteína (congelamento e descongelamento, ultra-som, imprensa francesa, outros). Cytosol fracionar 5-7 e núcleos e teste para a presença de suas proteínas de interesse. Desenvolver protocolos de purificação com base nos resultados para simplificar a purificação de proteínas. Considere a aplicação de procedimentos de imersão para extrair sua proteína da fração nuclear em condições de KCl elevados se os seus proteínas residem no núcleo. 7,18 </li><li> Purificação de proteínas (em grande escala micro-escala). Note-se que muitas vezes pequenos volumes (10 ou 25 ml) de cultura de células são sufficient para a obtenção de peletes celulares para purificar quantidades substanciais das suas proteínas de interesse devido aos tipicamente elevados ou muito elevados níveis de produção de proteínas heterólogas nos sistemas de células de baculovirus / insecto (geralmente 10-100 mg de proteína por L de cultura e mais). Em conjunto com micro-purificação (placas de vários poços, métodos MicroTip, sistema ÄKTAmicro GE Healthcare, outros), é possível obter dados bioquímicos e atividade e muitas vezes também quantidade suficiente de proteínas desejadas e complexos para nanoliter escala cristalização de alto rendimento (HTX ). Considere o uso de purificação de afinidade com metal (Clonetech Takara TALON, resinas quelantes de metais NiNTA Qiagen) e um oligo-histidina (resíduos 6-10) de etiquetas sobre subunidades expostas da sua proteína complexos para facilitar a purificação, conjuntamente com a troca iónica e cromatografia de exclusão de tamanho em pequenas volumes de, por exemplo, utilizando o ÄKTAmicro ou uma máquina de purificação pequeno volume semelhante (Figura 4 </stRong&gt;). Outros passos de purificação por afinidade e troca iónica passos (IEX), além da purificação por afinidade, com as marcações de oligo-histidina ou outras marcações (escolha de GST, MBP, CBP e outras) podem e devem ser considerados, de acordo com as propriedades bioquímicas das proteínas de interesses e preferências individuais. Considere marcação mais do que uma subunidade, com marcadores de afinidade para melhorar a eficiência da purificação. Concentre seus complexos de proteínas purificadas e estabelecer protocolos de armazenamento, tais como o congelamento com ou sem glicerol. Desenvolver critérios de controlo de qualidade que possam ser aplicadas de forma padrão (ensaios de actividade, ensaios bioquímicos e biofísicos) para avaliar a variação das suas proteínas purificadas de lote para lote. </li></ol>

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. 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J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB é inventor de patentes e aplicações de patentes detalhando partes da tecnologia aqui descrita.

Vídeo instantâneos nas Figuras 2 e 3 ilustram o processo inteiro de produção assistida por robô a partir do cDNA de expressão constrói multigenes todo o caminho para a infecção de culturas de células de insectos para a produção de proteína. Novos reagentes (plasmídeos e vírus) e os protocolos robustos têm sido desenvolvidos para permitir que uma conduta depender de PHF. Todo o oleoduto tem sido implementado como uma tecnologia de plataforma na EMBL, em Grenoble. A plataf...

A actividade biológica é controlada pela montagem de proteínas e outras biomoléculas que agem em conjunto para catalisar as funções celulares. Exemplos notáveis ​​incluem a maquinaria que transcreve a informação hereditária contida no DNA em RNA mensageiro. Nos seres humanos, mais de 100 proteínas em conjunto com um processo definido e regulado para transcrever os genes, formando grandes complexos multiproteicos com 10 e mais subunidades, incluindo a RNA polimerase II e os factores de transcrição gerais, como TFIID, TFIIH e outros. 9 Outros exemplos são o ribossoma, que consiste em muitas proteínas e moléculas de ARN que catalisa a síntese de proteínas, ou o complexo do poro nuclear, que é responsável pelo transporte biomoléculas através do envelope nuclear em eucariotas. A dissecção de arquitetura e bioquímica detalhada de essencialmente todas as máquinas com múltiplos componentes da célula é vital para compreender a sua função. A elucidação da estrutura de procariotas e eukarribossomos yotic, por exemplo, constituíram eventos marcantes produzindo uma visão sem precedentes sobre a forma como estas máquinas macromoleculares realizar suas funções designadas na célula 10,11. Os ribossomas podem ser obtidos em termos de qualidade e quantidade suficientes para um estudo detalhado por purificação do material endógeno a partir de células cultivadas, devido ao fato de que até 30% da massa celular consiste de ribossomas. RNA polimerase II já é menos abundante em ordens de magnitude e, em muitos milhares de litros de cultura de levedura teve de ser processada para se obter uma vista atómica detalhada deste complexo central e essencial para a transcrição. 12 A esmagadora maioria dos outros complexos essenciais estão presentes no entanto quantidades muito baixas em células nativas, e, portanto, não pode ser purificada de forma adequada a partir de material de origem nativa. Para produzir tais complexos acessíveis à análise estrutural e funcional detalhada exige a produção heteróloga recombinante usando TEchniques. Produção de proteínas recombinantes teve um grande impacto na pesquisa de ciências da vida. Muitas proteínas foram produzidos de forma recombinante, e a sua estrutura e função dissecado na alta resolução. Programas de genômica estrutural aproveitaram a elucidação dos genomas de muitos organismos para enfrentar o repertório de organismos inteiros no modo de alto rendimento (HT), produto do gene. Milhares de estruturas proteicas foram assim determinados. Até à data, o sistema mais usado para prolífica produção de proteínas recombinantes tem sido E. coli, e diversos sistemas de expressão têm sido desenvolvidos e refinada ao longo dos anos, para a produção heteróloga neste hospedeiro. Os plasmídeos contendo uma variedade de funcionalidades, para permitir a produção de proteínas em E. coli preencher catálogos inteiros de provedores comerciais. No entanto, E. coli tem certas limitações que o tornam inadequado para a produção de muitas proteínas eucarióticas e em pcomplexos de proteínas articulares com várias subunidades. Por conseguinte, a produção de proteínas em hospedeiros eucarióticos tornou-se cada vez mais o método de escolha nos últimos anos. Um sistema particularmente bem adequado para a produção de proteínas eucarióticas é o sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) que depende de um baculovírus recombinante portador dos genes heterólogos para infectar culturas de células de insectos cultivadas em laboratório. O sistema é um MultiBac BEVS desenvolvidos mais recentemente, que é particularmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas com várias subunidades (figura 1). MultiBac foi introduzido pela primeira vez em 2004. 13 Desde a sua introdução, MultiBac tem sido continuamente refinado e fluxo alinhada para simplificar a manipulação, melhorar a qualidade da proteína-alvo e, geralmente, tornando o sistema acessível a usuários não especialistas através da concepção de procedimentos operacionais padronizados (POPs eficientes). 4 MultiBac foi implementada em muitos laboratórios em todo o mundo, em acAdémia e indústria. No EMBL em Grenoble, programas de acesso transnacionais foram postas em prática pela Comissão Europeia para fornecer treinamento especializado na plataforma MultiBac para cientistas que pretendiam usar este sistema de produção para avançar suas pesquisas. A estrutura e função de muitos complexos de proteínas, que até agora não eram acessíveis foi elucidada utilizando amostras produzidas com MultiBac. 4 No seguinte, as etapas de produção essenciais MultiBac estão resumidos nos protocolos como estão em operação na instalação MultiBac no EMBL Grenoble.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

Proteômica pesquisa revelou a complexidade impressionante de proteomas eucarióticas em detalhes sem precedentes. É agora um conceito geralmente aceite de que as proteínas nas células principalmente não existem como entidades isoladas, mas exercem a sua actividade biológica, em associação com muitas outras proteínas, em seres humanos dez ou mais, formando as linhas de montagem na célula para a maior parte, se não todas as funções vitais. 1 , 2 Conhecimento da função e arquitetura destes conjuntos multiprotein requer sua prestação em qualidade superior e quantidade suficiente para uma análise detalhada. A escassez de muitos complexos de proteínas nas células, em particular em eucariotas, impede a sua extracção a partir de fontes nativas, e requer a produção recombinante. O sistema de vector de expressão de baculovirus (BEVS) provou ser particularmente útil para a produção de proteínas eucarióticas, a actividade da qual assenta o processamento pós-translacional que outros sistemas de expressão vulgarmente utilizados, muitas vezes podenão suporta. três BEVS usar um baculovirus recombinante no qual o gene de interesse foi introduzido para infectar culturas de células de insectos, que por sua vez produzem a proteína de escolha. MultiBac BEVS é um que foi especialmente adaptado para a produção de complexos de proteínas eucarióticas que contêm várias subunidades. 4 Um pré-requisito importante para a produção eficiente de proteínas e os seus complexos são protocolos robustos para todos os passos envolvidos na expressão de uma experiência que, idealmente, pode ser implementado como procedimentos operacionais padronizados (POPs) e seguido também por usuários não-especializados, com relativa facilidade. A plataforma MultiBac no Laboratório de Biologia Molecular Europeu (EMBL) utiliza PHF para todos os passos envolvidos na expressão de um complexo multiproteico experiência, começando a partir da inserção dos genes num genoma de baculovírus engenharia optimizado para as propriedades de produção de proteínas heterólogas a análise de pequena escala da proteína exemplares produzidos. 5-8 a plataformaestá instalado em um modo de acesso aberto no EMBL Grenoble e apoiou muitos cientistas de universidades e empresas para acelerar projetos de pesquisa complexos protéicos.

Forte co-expressão de proteínas heterólogas obtidas pelo sistema MultiBac é mostrado na Figura 1D (sondas feita 48 horas após a infecção de uma cultura de células em suspensão). As bandas de proteína overexpressed são claramente discerníveis no extracto de células inteiras (SNP) e o ligado clarificado (SN). A qualidade e quantidade do material de proteína produzida é muitas vezes suficiente, para permitir a determinação da estrutura dos complexos de proteína, tais como o ponto de verif...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

the-multibac-protein-complex-production-platform-at-the-embl

Research

JoVE Journal

Biology

15.8K visualizações.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidad...

Vídeo: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissecação bruta do Estômago da lagosta, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...