The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

NOTA: O procedimento pode ser realizado com tecidos congelados frescos ou Flash. Recomenda-se perfundir os tecidos altamente vascularizados com PBS no momento da dissecção para eliminar as células vermelhas do sangue e proteínas do plasma. Nós não recomendamos a realização do procedimento em tecidos fixados como fixação (isto é, reticulação química) interfere com decellularization e também pode comprometer significativamente posterior análise por espectrometria de massa. Para todo o procedimento, recomendamos o uso de tubos de baixa retenção e pontas de pipeta para maximizar a recuperação de proteínas e peptídeos. 1. Decelularização de tecidos ou tumores NOTA: Antes de começar, preparar os reagentes e adicionar inibidores de protease (fornecidos com o estojo de extracção de proteína) do compartimento para o volume desejado de cada tampão. Todos os tampões e as amostras devem ser mantidas em gelo durante a duração da experiência, excepto o tampão de CS que deve ser mantida a temperatura ambiente para evitar a precipitação de SDSitation. NOTA: O protocolo utiliza uma série de incubação em tampões de pH diferente e contendo diferentes quantidades de sais e detergentes sequencialmente proteínas intracelulares e de extracto para enriquecer proteínas ECM insolúveis (Figura 1, Tabela 1; ver também a discussão de alternativas para a utilização do kit comercial detalhado aqui). Os volumes de reagentes indicados abaixo são para 100 mg de tecidos ou tumores (ver Tabela 1) e ter de ser ajustada de forma apropriada. <ol><li> Homogeneizar 100 mg de tecido em 500 ul de tampão C contendo inibidores da protease usando um homogeneizador de tecidos até que o tecido está completamente interrompido e uma suspensão homogénea. NOTA: Adicionar desoxirribonuclease I (concentração final: 200 ng / ml, reconstituído de acordo com as instruções do fabricante) e ribonuclease A (concentração final: 20 ug / ml, reconstituído de acordo com as instruções do fabricante) paraTampão N. </li><li> Extracção sequencial de proteínas solúveis intracelulares <ol><li> Extracção de proteínas citosólicas. Incubar o homogenato num rotor tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Guardar a uma pequena aliquota (10 uL a 20 ul) do homogenato para subsequente análise de Western blot (ver secção resultados esperados e Figura 2). </li><li> Centrifuga-se o homogenato a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo, este irá constituir a fracção citosólica (C) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para lavagem, ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão W contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Centrifuga-se o homogenato a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Para extrair, proteínas nucleares, ressuspender o sedimento em 150 ul de tampão contendo inibidores de proteases de N, deoxyribonucleaSE I e ribonuclease A e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num tubo limpo. Repetir esta etapa uma vez: após centrifugação da amostra para o segundo tempo, adiciona-se o sobrenadante ao sobrenadante anterior: isto constitui o (N) a fracção de análise Western blot nuclear. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C. Em seguida, execute as lavagens como por etapa 1.2.3. </li><li> Para extrair as proteínas de membrana, ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão H contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 30 minutos a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C </li><li> Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo: este irá constituir a fracção de membrana (M) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para extrair proteínas do citoesqueleto, ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de CS contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num tubo de rotador durante 30 minutos à TA. Note-se que o pelete não se dissolvem totalmente. Sugerimos perturbar o pellet pipetando cima e para baixo até que observar perturbação do sedimento. </li><li> Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Recolhe-se o sobrenadante num tubo limpo. Nota neste ponto uma redução ainda mais acentuada no tamanho do pelete (ver vídeo). </li><li> Ressuspender o sedimento em 150 ul de tampão C contendo inibidores de protease e incuba-se a amostra num rotor de tubo durante 20 minutos a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e adicionar-se ao sobrenadante anterior: isto irá constituir a fracção do citoesqueleto (CS) da análise de mancha ocidental. O Flash congelar esta fracção e armazenar a -80 ° C. </li><li> Realizar lavagens adicionais. Ressuspender o sedimento em 500 ul de PBS contendo inibidores de protease deND incubar a amostra num rotor tubo durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Repita este passo três vezes. NOTA: Todos os vestígios de detergentes precisam ser removidos por extensos lavagens antes da digestão das proteínas em peptídeos (ver Secção 3). Neste ponto, o sedimento enriquecido em ECM podem ser congelados rapidamente e manteve-se a -80 ° C. Note-se que o tamanho do grânulo irá depender da quantidade de proteínas insolúveis (ECM) no material de partida e da eficiência da descelularização. </li></ol></li></ol> 2. Monitorização da Qualidade do Decelularização / Enriquecimento ECM por SDS-PAGE e Western Blot <ol><li> Misturar 10-20 ul alíquota do extracto de tecido total e aliquotas de 50 ul de fracções intermediárias com tampão Laemmli contendo DTT 100 mM. Ressuspender o, fração insolúvel enriquecida com ECM em 3x tampão Laemmli contendo DTT 100 mM. Nota: ele concentrações elevadasde DTT e SDS auxiliar na solubilização de proteínas de ECM que são relativamente insolúveis. </li><li> Separaram-se as proteínas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. </li><li> Realizar imuno-manchas utilizando anticorpos para monitorizar proteínas representativa de cada uma das fracções citosólicas, nucleares, de membrana, do citoesqueleto e ECM (ver a secção de resultados representativos, Tabela 2 e Figura 2). </li></ol> 3. Na solução de digestão de proteínas a péptidos para Análise de Espectrometria de Massa NOTA: O sedimento obtido após o procedimento descelularização e remoção do SDS é altamente enriquecidos em proteínas de ECM insolúvel para posterior análise por espectrometria de massa destas proteínas têm de ser digeridas em péptidos. Note-se que, como consequência da ECM insolubilidade da proteína, não é possível, nesta etapa para medir a concentração de proteína da amostra. Nós fornecemos assim volumes de reagentes para digerir o ECM-enriamostras CHEd em péptidos com base no tamanho (mm) ou o peso seco do sedimento enriquecido em ECM (Tabela 3). As soluções de bicarbonato de amónio, ureia, DTT, iodoacetamida e ácido trifluoroacético todos precisam ser preparados na hora. <ol><li> Ressuspender a amostra enriquecida com ECM através da adição do volume apropriado de 8 M de ureia ao sedimento enriquecido em ECM e adicionar DTT numa concentração final de 10 mM (ver Tabela 3). Incubar, com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. NOTA: neste momento as proteínas de ECM não será totalmente dissolvido e os visivelmente grandes partículas de proteínas não deve ser descartada por centrifugação ou filtração. A suspensão irá limpar após desglicosilação e digestão (ver vídeo). </li><li> Alkylation <ol><li> Preparar a solução iodoacetamida em água de grau HPLC. Arrefece-se a amostra até à temperatura ambiente e adicionar a iodoacetamida a uma concentração final de 25 mM. Para a alquilação completa, o DTT: iodoacetamida proporção deve ser entre 1: 2.5 e 1: 3. </li><li> Incubar no escuro durante 30 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Desglicosilaï¿½o: Nota: A desglicosilação é necessária para remover as cadeias laterais de hidratos de carbono que interferem com a identificação de péptidos modificados por glicosilação N -ligada. <ol><li> Dilui-se a 2 M de ureia com 100 mM de bicarbonato de amónio pH 8,0 e adicionar a quantidade apropriada de PNGaseF (ver Tabela 3). Incubar, com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Digestão <ol><li> Adicionar Lys-C e incubar com agitação contínua a 1400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. Adicionar tripsina e incubar com agitação contínua a 1400 rpm O / N a 37 ° C. NOTA: a suspensão rica em ECM, que começou nebuloso após a reconstituição inicial em ureia 8 parece claro após a digestão O / N (ver vídeo). </li><li> Adicionar uma segunda alíquota de tripsina à amostra e incubar com agitação contínua a 1400 rpm, durante mais 2 horas a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Acidificação <ol><li> Após a conclusão da digestão, inactivar a tripsina por acidificação da amostra preparada de fresco com ácido trif luoro-acético a 50% (TFA). A amostra deve atingir pH &lt;2. Sugerimos adicionando 1-1,5 uL de TFA a 50% de cada vez e usando 1 ml de solução de péptido para medir o pH da solução utilizando papel de pH (ver vídeo). </li><li> Centrifugar a amostra acidificada a 16000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante num tubo de baixa retenção limpo. Neste ponto, a solução de péptido pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol></li><li> Dessalinização Nota: que esta última etapa é geralmente conduzida a uma instalação de espectrometria de massa de acordo com seus próprios métodos preferenciais. <ol><li> Antes da análise proteómica, dessalinizar as amostras e péptidos eluidos com recentemente preparada de 60% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético a 0,1%, seguido por concentração num concentrador de vácuo. Ressuspender os péptidos em recém-preparado 3% acetonitrlie, 0,1% de ácido trifluoroacético 8. NOTA: que, após dessalinização, a concentração da solução de péptido pode ser medida por espectrofotometria (ver secção resultados esperados). </li><li> Agora, analisar a amostra por espectrometria de massa, mais uma vez de acordo com os procedimentos óptimos de a instalação de espectrometria de massa. NOTA: Nós encorajamos os pesquisadores interessados ​​em caracterizar a composição de ECMs utilizando espectrometria de massa para se referir às nossas outras publicações 8-10 e sites que fornecem explicação mais detalhada, incluindo os parâmetros de LC-MS / MS, pesquisa de dados de espectrometria de massa para identificação de proteínas e análise de dados utilizando o in silico matrisome ferramenta de anotação nós desenvolvemos 8. </li></ol></li></ol>

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Modificações Apesar de termos utilizado esse procedimento exato para enriquecer o ECM a partir de dez tecidos e tipos de tumores 8-10, modificações do protocolo devem ser consideradas nos seguintes casos: 1) Detecção de proteínas de ECM nas fracções intermédias. Matrizes extracelulares a partir de diferentes tecidos ou tipos de tumores podem diferir na sua extractabilidade / insolubilidade, como discutido acima para a fibronectina e lamininas. Por exemplo, pensa-se que a ECM de tecidos fibróticos ou tecidos remodelação vira muito dinamicamente e, portanto, pode-se observar uma maior proporção de proteínas de ECM nos tecidos a ser mais facilmente extraível 12. Dependendo da fracção no qual são detectadas proteínas da MEC, sugerimos a reduzir o tempo de incubação do passo provocando a extracção de proteínas de ECM ou omitindo este passo. 2) Detection de uma proporção significativa de componentes intracelulares no sedimento enriquecido em ECM. Em alguns tecidos ou tipos de tumor As células de relação: ECM é particularmente elevadas (por exemplo, tumores, do fígado, do baço, não desmoplásicas). Nesse caso, uma contaminação significativa da fracção enriquecida em ECM por proteínas intracelulares (em particular, proteínas do citoesqueleto e / ou histonas) podem ser observadas. Para esgotar as proteínas intracelulares de forma eficiente, sugerimos repetindo duas vezes a incubação em tampão H e / ou tampão CS (ambos contendo detergentes, este geralmente esgota abundantes proteínas intracelulares). Outra alternativa seria a utilização de tampões alternativos com concentrações mais elevadas de detergentes, com a ressalva de que isso pode levar ao esgotamento das proteínas da MEC relativamente mais solúveis, bem como (veja o próximo parágrafo). 3) alternativa à utilização de um kit comercial. Não foi possível, por razões de propriedade, para se obter a composição precisa dos buffers frosou o fornecedor do kit de extração de proteínas compartimental. No entanto, nós incluímos na Tabela 1 notas com base em nossa própria experiência usando buffers caseiros com detergente definido (NP-40, desoxicolato de sódio e SDS), as concentrações para realizar extrações similares. Um estudo recente também destacou a importância do pH de buffers de decelularização para reter proteínas da MEC 13. Limitações da técnica O método aqui apresentado baseia-se no facto de as proteínas de ECM são intrinsecamente mais insolúvel do que a maioria das proteínas intracelulares. No entanto, o método de descelularização descrito aqui certamente extrai os componentes solúveis presentes dentro da ECM, tais como alguns factores de crescimento ou enzimas-remodelação de ECM. Embora proteínas associadas a ECM firmemente ligados a proteínas da MEC foram detectados por proteómica em amostras preparadas como descrito, este método pode ser muito rigorosa ao perfil totalmente a composição de associados-matrisomeproteínas. Significância da técnica em relação a outros métodos A vantagem do método apresentado aqui em relação a outros métodos é que ele pode ser adaptado à natureza do ECM de interesse: passos intermédios podem ser omitidos ou repetidos para evitar a perda de proteínas de ECM ou aumentar a depleção de proteínas contaminantes intracelulares respectivamente. Este método também utiliza apenas quantidades mínimas de detergentes que são enxaguados para evitar a sua interferência com a preparação de péptidos subsequente e espectrometria de massa. Finalmente, o método descrito aqui para digerir preparações de proteína rica em ECM em peptídeos tem também a vantagem de não necessitar de proteínas de ser solúvel e pode ser realizado em fracções enriquecidas com ECM &quot;em bruto&quot;. Métodos alternativos de decelularização utilizando agentes caotrópicos (tais como cloridrato de guanidina) para estudar a composição de ECMs por espectrometria de massa têm been relatado na literatura (revisto em 14) e têm sido utilizados em combinação com espectrometria de massa para caracterizar a composição ECM de cartilagem 15,16, 17 coração, glândula mamária 18 e vascular 19 e 20 as membranas basais glomerulares. Recomendações Descelularização métodos empregando tripsina para digerir as células não deve ser utilizado se ECMs são enriquecidos para proteómica subsequentes análises, como tripsinização resultará na digestão de ECM parcial e perda de proteínas da MEC e péptidos. Da mesma forma, se a digestão de colagenase foram para ser utilizada para auxiliar rompimento do tecido, ele terá de ser monitorizada cuidadosamente, uma vez que faz com que a digestão e perda de proteínas da MEC e péptidos ECM. Em solução-vs digestão em gel? Proteínas de ECM são reticulados e altamente insolúveis e, mesmo quando ressuspensas em tampão de Laemmli 3x (contendo 6% de SDS) e 100 mM de DTT, po separadoorly em geles de SDS. Assim, a digestão em gel não é um método preferido. As aplicações futuras Vale a pena notar que, enquanto não discutido aqui, a composição de cada uma das fracções de intermediário recolhidos durante a descelularização pode também ser analisados ​​por espectrometria de massa. Isto pode ser particularmente útil quando se estuda amostras muito pequenas (isto é, biópsias humanas) ou quando a informação é desejado em outras fracções celulares.

A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexa de proteínas reticulado e glicosiladas que fornece suporte de arquitetura e de ancoragem para as células e define, em parte, as propriedades biomecânicas de tecidos 1,2. Proteínas ECM também um sinal para as células, quer directamente através dos seus receptores (por exemplo, integrinas, sindecans, etc.) ou através da modulação do factor de crescimento de sinalização 3. A ECM fornece, assim, sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores de processos celulares tais como a proliferação, a sobrevivência, a polarização, diferenciação, migração, etc. O ECM desempenha papel fundamental na fisiologia, desenvolvimento e envelhecimento 4. Além disso, várias patologias, como doenças cardio-vascular, fibrose, doenças músculo-esqueléticas, cânceres, são causadas por, ou resultar em alterações de ECM. Além disso, o ECM contribui para a manutenção de nichos de células-tronco e a identificação de moléculas de ECM chave thno apoio stemness terá aplicação directa em engenharia de tecidos e medicina regenerativa 5. No entanto, apesar da sua importância, o ECM manteve-se, até recentemente, pouco explorado 6. Em silico análise revelou que o matrisome, definido como o conjunto de ECM e proteínas associadas à ECM, compreende os produtos de várias centenas de genes nos genomas tanto a humanos e de ratinho 1,7,8. No entanto, a insolubilidade das proteínas da MEC tem dificultado a caracterização sistemática da composição in vivo de matrizes extracelulares de espécimes normais e patológicas. Nós recentemente demonstrado que esta insolubilidade poderia ser transformado em vantagem e ser usado para enriquecer proteínas ECM 8-10. Nós e outros ainda demonstrado que a espectrometria de massa foi um método de escolha para caracterizar a composição de ECMs 8-10, 13. NósDescrevemos aqui um procedimento decellularization que consiste em incubações sequenciais em buffers de diferentes pH e concentrações de sal e detergentes. Este procedimento resulta na extracção (ou depleção) de proteínas citosólicas, nucleares, da membrana e do citoesqueleto e o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevemos como digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa. Utilizando os procedimentos detalhado e ilustrado aqui, temos enriquecido com sucesso e caracteriza-se por espectrometria de massa das matrizes extracelulares de dez diferentes tecidos e tipos de tumores: pulmão normal murino 8, humanos e de cólon murino 8,9, fígado humano 9, tumores colorretais humanos e derivados metástases hepáticas 9, xenoenxertos de melanoma 8, xenotransplantes tumorais mamárias 10, ilhotas pancreáticas murinas e insulinomas murino (Naba et al., não publicado). Comparação das diferentes matrisomES revelou assinaturas ECM para tecidos e específicos de tumores que podem ainda ser utilizados como biomarcadores potenciais de diagnóstico ou de prognóstico. Acreditamos que este procedimento pode ser aplicado a outros espécimes sem ou relativamente pequenas modificações.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

A matriz extracelular (ECM) é uma malha complexo de proteínas reticuladas que fornece sinais biofísicas e bioquímicas que são importantes reguladores da proliferação celular, sobrevivência, migração, etc. O ECM desempenha papéis importantes no desenvolvimento e em diversas patologias incluindo cardio-vascular e doenças músculo-esqueléticas, fibrose e câncer. Assim, a caracterização da composição de ECMs de tecidos normais e doentes pode levar à identificação de novos marcadores de prognóstico e de diagnóstico e terapêuticas potenciais alvos. No entanto, a própria natureza das proteínas da MEC (grandes em tamanho, com ligações cruzadas e ligados covalentemente, fortemente glicosilada) tornou análises bioquímicas de ECMs desafiador. Para superar este desafio, desenvolvemos um método para enriquecer ECMs a partir de tecidos e tumores frescos ou congelados que tira proveito da insolubilidade das proteínas da MEC. Nós descrevemos aqui em pormenor o procedimento decellularization que consiste em i seqüencialncubations em tampões de diferente pH e concentrações de sal e de detergente e que resulta em 1) a extracção de intracelular (citosólica, nuclear, membrana do citoesqueleto e) proteínas e 2) o enriquecimento de proteínas da MEC. Em seguida, descrevem como deglycosylate e digerir preparações de proteína enriquecido com ECM em peptídeos para posterior análise por espectrometria de massa.

O controle de qualidade do processo de descelularização A eficiência da descelularização pode ser monitorizada por análise do teor em proteína de cada fracção por western blot. A Tabela 2 lista as proteínas de valor de diagnóstico para avaliar a qualidade do processo de descelularização. A Figura 2A mostra a extracção eficiente nas fracções intermédias de citosólica (GAPDH ), (histonas nucleares), a membrana (β1 integrina) e do citoesqueleto () proteínas actina, ao passo que não há proteínas de ECM (colagénio I) é detectada nestas fracções (Figura 2). Por sua vez, o pelete final é enriquecida em proteínas da MEC e largamente empobrecido de proteínas intracelulares (Figura 2A). A Figura 2B apresenta a depleção de proteínas intracelulares satisfatório (nenhum histona é detectado na fracção rica em ECM), embora, a actina pode ainda ser detectado na a fracção e do esgotamento de colágeno monomérica I-ricos ECM- Peso molecular aparente de ~ 110 kDa, presumivelmente correspondentes ao colagénio desmontado I - pode ser observada na fracção CS. Também rotineiramente monitorar proteínas de ECM adicionais, tais como a fibronectina e laminina, embora, em alguns tecidos, estes componentes podem ser parcialmente solubilizado em fracções anteriores 8-10. Por exemplo, a fibronectina também ocorre como fibronectina do plasma solúvel que não é incorporado no ECM. A perfusão do tecido antes da extracção reduz a concentração de fibronectina do plasma, mas não sempre eliminá-lo. Em alguns tecidos, lamininas são encontrados em certa medida associada com a superfície da célula ou a ECM e extracto nas fracções intermédias. Se isto acontece ele pode ser abordada por alteração das condições de extracção (ver discussão). Note-se que o enriquecimento de proteínas da MEC e a depleção concomitante de componentes intracelulares baseia-se na solubilidade relativa de proteínas em diferentes tampões. ºé diferente entre os diferentes tecidos - em alguns casos, as histonas e actina são mais facilmente extraída do que em outros. Note também que, embora histonas são esperados para ser extraída na fracção N (Figura 2B), que muitas vezes observar uma depleção mais completa de histonas no H ou fracção CS (Figura 2A e B). Indicativa da concentração de péptido esperado A concentração da solução de péptido obtido após a digestão, a acidificação e dessalinização pode ser medida por espectrofotometria quer por medição da absorvância da solução de péptido usando o comprimento de onda de 280 nm, correspondendo a triptofano, tirosina, ou usando o comprimento de onda de 205 nm, correspondendo a absorvância do peptídeo obrigações. Medimos a concentração das soluções de péptidos obtidos a partir da descelularização de três amostras de pulmões murinos (82 mg, 100 mg e 100 mg, respectivamente) Prepavermelho em paralelo e obtido a partir de cada um: 424 ng / mL, 450 ng / mL, e 580 ng / uL de péptidos, respectivamente. Identificação de péptidos por espectrometria de massa de ECM A análise por espectrometria de massa da composição de amostras de proteína enriquecido com ECM, preparados como descrito aqui, mostraram que&gt; 70% da intensidade de sinal corresponde à ECM e proteínas associadas à ECM 8-10. Tabela 1. O volume de reagentes de kit de extração compartimental para decellularize 100 mg (peso húmido) de tecido ou de tumor. Esta tabela lista a composição e o volume de cada tampão usado para realizar a descelularização de 100 mg de tecido ou tumor. Um cocktail de inibidores de protease é fornecida como uma solução 50x e deve ser adicionado a cada tampão 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagentes de Kit Compartimento de extração de proteínas </td><td> Volume de 100 mg de tecido </td><td> Composição (com base na folha de dados Millipore Cat # 2145 1) </td></tr><tr><td> Tampão C </td><td> 500 ul </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio 5 </td></tr><tr><td> Tampão W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> Tampão N </td><td> 150 mL x 2 </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, Glicerol, ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> Tampão W </td><td> 400 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> M de tampão </td><td> 100 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, desoxicolato de sódio (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> Tampão CS </td><td> 200 ul </td><td> PIPES (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sacarose, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 7, ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> Tampão C </td><td> 150 ul </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, sacarose, glicerol, ortovanadato de sódio </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 l / lavagem </td><td> - </td></tr></tbody></table> Notas: 1 Por motivos de propriedade, não fomos capazes de obter a composição precisa dos buffers do fornecedor do kit, mas nós incluímos aqui algumas notas com base em nossa própria experiência usando buffers caseiros para realizar extrações similares. 2 de inibidores da protease: é aconselhável incluir uma variedade de inibidores contra cisteína, serina e treonina peptidases, esterases de serina, metaloproteinases dependente de catiões divalentes, etc.Existem muitos cocktail de inibidor de protease disponíveis comercialmente. 3 o pH acima de 7,0 é um inibidor eficaz de proteases lisossómicas. 4 EDTA (geralmente utilizada em 2 mM) é um inibidor eficaz de proteases dependentes de catiões divalentes. 5 ortovanadato de sódio é um inibidor de fosfatase. Uma concentração típica eficaz seria 0,5-5 mM. 6 NP40 a 0,1% -0,5% é suficiente para solubilizar mais lípidos de membrana. A combinação de NP40 e DOC - muitas vezes utilizado em concentrações iguais (por exemplo, 0,5% de cada) - é frequentemente utilizado como uma extracção mais rigoroso que deixa ainda muitas interacções proteína-proteína intacta. 7 SDS é um detergente iónico mais rigorosas (CMC 0,1%). Ele também pode ser usado em combinação com os outros dois detergentes SDS / NP40 / DOC a 0,1 / 0,5 / 0,5% como tampão de restringência intermédia. Tabela 2. proteínas de diagnóstico paramonitorizar a qualidade do processo de descelularização. Esta tabela lista exemplos de proteínas que são características de cada compartimento subcelular (citosol, núcleo, membrana de plasma, citoesqueleto e ECM) que pode ser utilizado para monitorizar a qualidade do processo de descelularização e a eficiência do ECM-enriquecimento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Intracelular Compartimento </td><td> Proteínas de diagnóstico </td></tr><tr><td> Proteínas citosólicas </td><td> Desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) </td></tr><tr><td> As proteínas nucleares </td><td> Histonas, laminas, Nucleoporin </td></tr><tr><td> As proteínas da membrana </td><td> As integrinas, Receptor de Transferrina </td></tr><tr><td> Proteínas do citoesqueleto </td><td> Actina, tubulina, Vimentina </td></tr><tr><td> ECM proteínas da membrana basal </td><td> Colágeno IV, Nidogens, lamininas </td></tr><tr><td> ECM proteínas intersticiais (intersticiais) </td><td> Colágeno I, colágeno III, colágeno VI, Fibronectina </td></tr></tbody></table> Para recomendação sobre anticorpos, consulte nossas publicações 8-10. Tabela 3. Volume de reagentes para digerir as amostras enriquecidas com ECM em péptidos. Esta tabela lista os reagentes utilizados para voltar a suspender amostras de proteína enriquecido em ECM e reduzir, alquilato, deglycosylate e digerir amostras de proteínas em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Preparação </td><td> Concentração / Valor final para pellet um milímetro de espessura (~ 5-10 mg de peso seco) </td><td> Volume de pellet 1 milímetro de espessura (~ 5-10 mg de peso seco) </td></tr><tr><td> Bicarbonato de amónio (NH 4 HCO 3) </td><td> Solução 100 mM em água de grau HPLC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> 8 M de solução em 100 mM de bicarbonato de amónio </td><td> 8 M </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Ditiotreitol </td><td> Reconstituir em água de grau HPLC em 500 mM </td><td> 10 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Iodoacetamida </td><td> Reconstituir em água de grau HPLC em 500 mM </td><td> 25 mM </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Pï¿½tido N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> Solução comercial a 500 U / mL </td><td> 1000 U </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> A endoproteinase LysC, espectrometria de massa de grau </td><td> Reconstituir em água HPLC-grade a 0,5 mg / mL </td><td> 1 ug </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Tripsina, espectrometria de massa de grau (1ª rodada) </td><td> Solução comercial a 0,5 mg / mL </td><td> 3 ug </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Tripsina, espectrometria de massa-grade (Fase 2) </td><td> Solução comercial a 0,5 mg / mL </td><td> 1,5 ug </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> Ácido trifluoro-acético (TFA) </td><td> Solução a 50% em água de grau HPLC </td><td> - </td><td> 2-5 ul </td></tr><tr><td> Acetonitrilo (eluição) </td><td> Solução a 60% com 0,1% de TFA em água de grau HPLC </td><td> - </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Acetonitrilo (reconstituição) </td><td> Solução de 3% com 0,1% de TFA em água de grau HPLC </td><td> - </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Esquema do procedimento experimental. Esquemático do fluxo de trabalho Protocol para decellularize tecidos (Seção 1), controlar a qualidade da descelularização e avaliar o enriquecimento ECM (Seção 2) e digerir amostras de proteína enriquecido com ECM em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa (Seção 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. controlo de qualidade do procedimento de descelularização por western blot Western blot foram realizadas no pulmão murino (A) e xenoenxerto de carcinoma da mama humano (B) amostras utilizando os seguintes anticorpos:. De coelho anti-actina (clone 14-1) e anti-coelho -β1 integrina anticorpos produzidos no nosso laboratório; de coelho anti-colagénio I, de ratinho anti-GAPDH e anticorpos de coelho anti-pan-histonas era da Millipore. Após incubação do anticorpo primário, as membranas foram lavadas e incubadas na presença de HRP-conjugado de cabra anti-coelho ou de cabra anti-mouse o anticorpo secundário a partir de Jackson ImmunoResearch Laboratory. Finalmente, as membranas foram lavadas e incubadas em Reagente Ocidental relâmpago ™ quimioluminescência (PerkinElmer LAS). * Indica contaminação histona residual mínima da fracção rica em ECM. ** Indica esgotamento parcial de monomérico (presumivelmente desmontado) colágeno I na fração CS. *** Indica contaminação actina residual da fracção rica em ECM. O esfregaço detectado com o anticorpo anti-colagénio representa diferentes níveis de modificações pós-translacionais (por exemplo, ligação cruzada, glicosilação).

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Research

JoVE Journal

Biology

26.6K visualizações.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pressão atmosférica Imagem Molecular de tecidos biológicos e Biofilmes por LAESI Espectrometria de Massa

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...