A perseguição radioativa de pulso usando 35 methionina e cistíne ainda é o único método bioquímico para investigar a biossíntese proteica com o tempo em células vivas. A biosíntese proteica abrange tanto a tradução, a dobra e a montagem, quanto o tráfico e a degradação. A combinação da perseguição de pulso radioativo com a análise de modificações proteicas de co-e pós-tradução, como a formação de vínculos de dissulfeto e acetilação fornece um ensaio sensível e quantitativo para investigar a fé da proteína com o tempo.
Um bom foco e manuseio experimental são necessários para este procedimento. Uma boa preparação é crucial, como tampões, seu espaço de trabalho radioativo e um cronograma claro. Este vídeo fornece uma visão clara sobre a visão do ombro do protocolo de perseguição de pulso radioativo.
Demonstrando o procedimento será Hui Ying Yeoh, um candidato a pHd do nosso laboratório. Para iniciar esse procedimento, transfeto de sementes e células culturais como descrito no protocolo de texto. Antes da perseguição de pulso, inspecione suas células através do microscópio.
Em seguida, lave os pratos com dois mililitros de tampão de lavagem. E dois mililitros de fome médio para as células e colocar os pratos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Certifique-se de que sua perseguição de pulso está em ordem.
Transfira os pratos para os racks no banho de água, pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Certifique-se de que os pratos estão em contato com a água, mas não flutue. Então, comece um temporizador.
Em 40 segundos, aspire o meio de fome. Usando uma micro pipeta, elave 600 microlitros de solução de pulso. Em exatamente um minuto, adicione suavemente a solução de pulso ao centro do prato.
Repita este processo de remoção do meio de fome e adicionar a solução de pulso para os pratos restantes em intervalos de um minuto. Exatamente em 11 minutos e para todos os pratos seguintes, de acordo com o esquema de perseguição de pulso, exceto para a amostra de perseguição de zero minuto, adicione dois mililitros de perseguição diretamente ao prato. Aspire o meio de perseguição e substitua-o por dois mililitros de meio de perseguição fresco.
Repita este processo para todos os pratos restantes em intervalos de um minuto. Quando o temporizador ler exatamente 16 minutos, adicione dois milicianos de meio de perseguição diretamente ao prato de perseguição de zero minuto, em cima do meio de pulso, para parar de rotular. Aspire imediatamente o meio.
Transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado e adicione dois milicianos de tampão de parada gelada. Transfira todos os outros pratos para uma incubadora a 37 graus Celsius. Transfira cada prato de perseguição de volta da incubadora para o banho de água dois minutos antes do fim de cada tempo de perseguição.
Na hora exata de perseguição para cada prato, aspire o meio de perseguição e transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado. Adicione dois mililitros de tampão de parada gelada. Deixe todos os pratos no gelo e pare o tampão até que haja tempo para lise as células.
Em seguida, aspire a solução stop e lave todos os pratos. Três ao mesmo tempo com dois mililitros de solução de parada gelada. Aspire completamente a solução stop e adicione 600 microliters de tampão de lise a dois pratos de cada vez.
Usando um raspador de célula, raspe bem a superfície do prato, mas delicadamente para misturar o lise. Transfira lysate de cada prato para um tubo fresco de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 15.000 a 20.000 G a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar os núcleos.
Para a perseguição de pulso em células de suspensão, a coleta de 5 milhões de células por ponto de tempo em um tubo de 50 mililitros. Realize o procedimento de fome conforme descrito no texto. Após o procedimento de fome no banho de água por 15 minutos, inicie o temporizador.
Em exatamente um minuto, adicione 275 microcuries de etiqueta não diluída diretamente ao tubo contendo células e redemoinho para misturar. Em exatamente 11 minutos, adicione quatro mililitros de mídia de perseguição para parar a rotulagem. E transfira imediatamente um mililitro para um tubo de 15 mililitros no gelo que contém nove mililitros de solução de parada gelada para parar de rotular.
Repita este processo de transferência de um mililitro de perseguição para um tubo no gelo contendo nove mililitros de solução de parada para cada ponto de tempo de perseguição sucessivo. Após a imunoprecipitação, aspire a última lavagem completamente. Suspenda as contas em 20 microliters de tampão de TE e vórtice.
Adicione 20 microliters de dois buffer de amostra X sem o agente redutor. Vórtice as amostras e depois aquecê-las a 95 graus Celsius por cinco minutos. Vórtice as amostras novamente.
Centrífuga a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto. Transfira 19 microlitadores do supernatante não reduzido para um tubo de microcentrifuuge fresco que contém um microliter de 500 mililitros DDT. Se necessário, centrifufique a amostra rapidamente para que todos os líquidos estejam na parte inferior.
E aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Deixe a amostra reduzida esfriar e, em seguida, vórtice. Centrifugar as amostras reduzidas e não reduzidas a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto e, em seguida, adicionar 1,1 microliters de um BAfárário molar a todas as amostras.
Neste estudo, uma abordagem de perseguição de pulso radioativa é usada para analisar a dobra de proteínas e o transporte em células intactas. A dobra e secreção do HIV 1 GP120 de uma perseguição de pulso aderente é mostrada aqui. O gel não redutor mostra o dobrável oxidativo de GP120.
Imediatamente após a rotulagem de pulso, ele aparece como uma banda difusa mais alta no gel. À medida que a perseguição progride, a banda migra para baixo do gel através de intermediários dobráveis ainda mais difusos até que se acumula na faixa apertada que representa nativamente dobrada no GP120. Isso ocorre à medida que a formação de ligações de dissulfeto aumenta a compactação da proteína, fazendo com que ela migrem mais rápido do que a proteína totalmente reduzida.
No gel redutor, as ligações de dissulfeto e todas as moléculas foram reduzidas e não afetam a mobiilty. Como tal, as diferenças de mobilidade são apenas o resultado de mudanças na massa molecular. A mudança ao longo do tempo da forma de peptídeo de sinal reduzido para a forma reduzida de peptídeo de sinal cleaved representa o decote de peptídeo de sinal pós-translacional de GP120.
A mobilidade aumenta devido à perda do peptídeo de sinal que aumenta durante a perseguição à medida que mais proteínas atingem a dobra nativa e perdem seu peptídeo de sinal. Tanto no gel não redutor quanto na redução, o sinal começa a diminuir a partir de aproximadamente uma hora devido à secreção do GP120. Isso pode ser monitorado analisando a mídia.
Este método é aplicável a qualquer linha celular, incluindo modelos de células organoides. Mas o sucesso depende muito do nível de expressão da proteína de interesse. Antes de iniciar este procedimento, marque seus pratos e mantenha esta ordem durante todo o experimento.
Certifique-se de que tudo esteja preparado antes de adicionar meio de fome. Este é o começo do experimento. E seu tempo de laboratório é seu amigo, mas pode ser seu maior inimigo quando você não está preparado.
A perseguição de Bill pode ser combinada com proteólise limitada para investigar toda a propriedade de proteínas com o tempo. Além disso, diferentes métodos de freezers eleitos permitirão a análise de enxágüe ou rigormorização ou diferenças de carga. Para proteger o pesquisador e o aparelho, todas as regras locais de segurança da radiação devem ser obedecidas.
E medidas protetivas devem ser tomadas de acordo com o protocolo. Note que sua acrilamida, usada para sua página STH, é neurotóxica.
