O PEM de DNA multicolorido 3D permite a visualização de múltiplos loci genômicos dentro de núcleos preservados para definir ambíguamente sua interação recíproca e localização a nível único celular. O PEIXE DE DNA multicolor 3D permite a investigação direta da arquitetura nuclear. Em geral, funciona em conjunto com tecnologias baseadas em captura de cromossomo, tornando a técnica uma ferramenta disponível para validação de dados C dentro de células únicas.
O procedimento será Federica Marasca. Ela é pós-doutora no meu laboratório. Comece incubando a mistura de tradução nick em uma batedeira térmica a 16 graus Celsius de acordo com o comprimento do material de DNA inicial.
No final da incubação, verifique o tamanho das sondas em um gel de 2,2%. Para cada experimento de PEIXE DE DNA, precipitar a quantidade apropriada de sonda de acordo com o material de DNA inicial do qual as sondas foram produzidas em 150 microliters de água dupla destilada, 20 microgramas de DNA de espermatozoide de salmão sem rótulo, 3,5 microgramas de espécies específicas de DNA Cot-1, três volumes de 100% etanol, e um volume de 1/10 de três acetato de sódio molar por uma hora a menos 80 graus Celsius. No final da incubação, centrifugar a amostra em velocidade máxima por uma hora a quatro graus Celsius.
Depois de descartar o supernascer, lave a pelota duas vezes com 500 microliters de 70% de etanol. Após a segunda lavagem, resuspenque a pelota em dois microlitadores de 100% formamida e agite a sonda por 30 minutos a 40 graus Celsius antes de adicionar um volume igual de citrato de sódio salino de 4X em sulfato de 20% dextran. Para a fixação pré-tratamento e permeabilização de pequenas células com núcleos pequenos e uma baixa quantidade de citoplasma, primeiro adicione duas vezes 10 às sextas células em 200 microliters de PBS diretamente em tampas de vidro em poços individuais de uma placa de 24 poços e permita que as células se acomodem por 30 minutos à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, substitua rapidamente o PBS por 300 microliters de 4%de paraformaldeído recém-preparado complementado com 0,1%Tween 20. Após 10 minutos, lave as células fixas três vezes em 300 microliters de 0,05% TPBS por cinco minutos por lavagem em temperatura ambiente. Após a última lavagem, permeabilize as células T com 300 microliters de 0,5% TPBS por 10 minutos em temperatura ambiente antes de tratar as células com 250 microliters por poço de coquetel RNAse diluído 1:100 em PBS por uma hora a 37 graus Celsius.
No final da incubação, enxágüe as células em 300 microliters de PBS e adicione 300 microlitrais de 20% de glicerol em PBS a cada poço com uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque o vidro em gelo seco por 15 a 30 segundos para congelar as células antes de gradualmente descongelar as amostras à temperatura ambiente e encharcá-las em 300 microlitrais de 20% de glicerol na PBS por 30 segundos. Após congelar/descongelar as células mais três vezes como apenas demonstrado, lave as amostras em 300 microliters de 0,5% TPBS por cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em 300 microliters de 0,05% TPBS por cinco minutos por lavagem à temperatura ambiente.
Após a última lavagem, trate as células com 300 microlitres de ácido clorídrico normal de 0,1 por 12 minutos em temperatura ambiente, seguido por duas enxágues em 300 microliters de citrato de sódio salino. Em seguida, fixar as amostras durante a noite em 300 microliters de 50% de formamida em 2X citrato de sódio salino a temperatura ambiente. Para a fixação, pré-tratamento e permeabilização de células grandes com alta quantidade de citoplasma, correção, pré-tratamento e permeabiliza as células de forma semelhante à demonstrada para células T primárias humanas e tratar as amostras com 300 microlitres de 0,0025% pepsina em 0,01 ácido clorídrico normal por alguns segundos até cinco minutos.
Observe as células sob um microscópio óptico e pare a reação com duas lavagens de cinco minutos em 300 microlitros de 50 milônios cloreto de magnésio assim que os núcleos estiverem livres do citoplasma, mas os nucleoli ainda estão visíveis e intactos. Para o 3D multicolor DNA FISH, desnaturar as sondas de hibridização a 80 graus Celsius por cinco minutos e colocar imediatamente as sondas no gelo. Carregue as sondas em um slide de microscópio limpo e coloque uma mancha de células em cada gota da sonda.
Sele as bordas da tampa com cimento de borracha. Quando o cimento secar completamente, desnatura as amostras em um bloco de aquecimento de 75 graus Celsius. Após quatro minutos, higmite as amostras a 37 graus Celsius durante a noite em uma caixa metálica flutuando em um banho de água.
Na manhã seguinte, retire o cimento de borracha e com os slides imersos em citrate de sódio salino 2X cuidadosamente decole as tampas. Coloque cada deslizamento em poços individuais de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de citrato de sódio salino fresco por poço para duas lavagens de cinco minutos a 37 graus Celsius com agitação a 90 revoluções por minuto. Ao final da incubação, enxágue as tampas brevemente em dois mililitros de 0,2% Tween 20 em citrato de sódio salino 4X.
Para detecção de PEIXEs de DNA multicolores 3D, transfira as tampas para poços individuais de uma nova placa de 24 poços e bloqueie qualquer ligação inespecífica em 300 microliters de tampão de bloqueio por 20 minutos a 37 graus Celsius e 20 revoluções por minuto. Ao final da incubação, trate as amostras com a concentração adequada de anti-digoxigenina e/ou streptavidina diluída em tampão de bloqueio por 35 minutos em uma câmara escura e úmida a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, transfira as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços e lave as amostras três vezes em dois mililitros de 0,2%Tween 20 e 4X soro fisiológico citrato por cinco minutos por lavagem com agitação a 90 revoluções por minuto.
Após a última lavagem, equilibre as amostras em dois mililitros de PBS antes de transferir os deslizamentos para uma nova placa de 24 poços para pós-fixação em 300 microliters de 2% de formaldeído em PBS por poço por dois minutos à temperatura ambiente. Lave as células fixas cinco vezes brevemente em 300 microliters de PBS, seguida de coloração com DAPI diluída a um nanograma por mililitro em 300 microlitres de PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Lave as tampas mais cinco vezes em PBS e monte as amostras com um meio de montagem apropriado.
Em seguida, adquira imagens 3D com um sistema de microscópio. O PEM DE DNA multicolorido 3D permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados. Para a preparação da sonda de DNA, um tamanho de sonda de menos de 200 pares de base garante um procedimento bem sucedido de PEIXE DE DNA multicolorido 3D.
Sondas de PEM de DNA subótidas produzidas pela tradução de nick podem ser parcial ou super digeridas. As sondas sobre digeridas resultarão em um sinal inespecífico devido à perda de especificidade na hibridização e a um consequente aumento do fundo. Para linfócitos T primários humanos e pequenas células com núcleos pequenos e uma baixa quantidade de citoplasma, recomenda-se um tratamento normal de ácido clorídrico de 12 minutos 0,1 para promover a acessibilidade dos núcleos às sondas de DNA e preservar a integridade nuclear.
A digestão citoplasmática da pepsina não é necessária para obter um bom sinal de DNA FISH em pequenas células. Para os míbios primários humanos e células que têm núcleos grandes e citoplasma abundante, no entanto, o passo da pepsinização é fundamental. Uma pepsinização de citoesqueleto curto e subótimo dificultará a entrada da sonda nos núcleos que terminam na ausência de um sinal de DNA FISH.
No entanto, se as células forem supere pepsinizadas, os núcleos não permanecerão intactos perdendo sua estrutura 3D. Um BEM sucedido PEM DE DNA multicolorido 3D resultará na presença de sinal dentro dos núcleos. Sugiro trabalhar com material biológico fresco, testar sondas antes de realizar o PEIXE de DNA multicolor 3D, preparar novas soluções e ser preciso com os tempos de incubação e as temperaturas.
Lembre-se que a formamida e o HCL são substâncias perigosas e devem ser sempre usados em uma capa de fumaça química com materiais descartáveis apropriados.
