A candida é a causa mais comum de infecção fúngica disseminada em hospedeiros imunocomprometidos. A falha dos agentes terapêuticos em se infiltrar plenamente no biofilme por causa da matriz é uma das razões pelas quais os biofilmes resistem às terapias tradicionais. Nosso protocolo avalia como a fototerapia, usando luz vermelha, interfere no crescimento e arranjo de biofilmes candida albicans.
Os métodos aplicados estão bem estabelecidos, uma vez que a cepa utilizada neste estudo teve sua matriz extracelular caracterizada e o dispositivo leve foi aplicado com sucesso a outras suspensões e biofilmes de microrganismos plantônicos. A maior vantagem deste dispositivo é a redução do tempo de tratamento, o que o torna mais visível para aplicações clínicas. Ao culminar candida albicans esteja ciente de que anticorpos podem ser adquiridos.
Por isso, é importante não usar colônias com mais de sete dias de idade, não iniciar placas a quatro graus Celsius, e não re-listrar células de placas existentes. Da mesma forma, uma cepa deve ser usada antes de 18 horas de crescimento noturno. Ao usar um espectrômetro pela primeira vez é importante primeiro obter a fazenda colônia em contagem de unidades, para se correlacionar com valores de densidade óptica.
Portanto, os experimentos começarão a usar a fase de crescimento em fase inicial de concentração celular de 10 a sete células por mililitros. Esta concentração celular tem sido demonstrada para fornecer os biofilmes de matéria mais dependente e estável. Para começar, suspenda 65 gramas de SDA, suplementado com 50 miligramas por litro de Clororamfenicol, em 1.000 mililitros de água destilada em um béquer.
Coloque o béquer em uma campainha para ferver, a fim de dissolver completamente o meio. Então transfira a mídia para uma garrafa de vidro. Coloque a tampa sobre a garrafa, mas não astrague completamente para garantir que a garrafa seja capaz de ventilar.
Coloque a garrafa em uma autoclave para esterilizar a solução a 15 PSI e 121 graus Celsius por 30 minutos. Esfrie a solução para cerca de 45 graus Celsius. Use uma pipeta descartável e estéril, para misturar bem, e pipeta 20 mililitros de SDA em placas estéreis de Petri.
Para preparar o meio YNB, suplementado com 100 milimonas de glicose, misture 6,7 gramas de YNB e 18 gramas de dextrose a 1.000 mililitros de água ultra pura em um béquer. Coloque uma barra de mexida no béquer e coloque o béquer em uma placa de mexida para misturar. Filtre o meio através de um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro para esterilizar.
Prepare o meio RPMI misturando 10,4 gramas de RPMI-1640 e 34 gramas de MOPS, a 1.000 mililitros de água ultra pura. Misture em um agitador sem calor e ajuste o PH para sete adicionando um hidróxido de sódio normal. Esterilize o meio usando um sistema de filtro de vácuo de 0,22 micrômetro.
Primeiro, descongele o microrganismo Candida albicans SN 425 à temperatura ambiente. Semente 10 microliters da cultura stop em pratos petri previamente preparados contendo SDA, complementados com Clororamfenicol. Incubar as placas de Petri aerobicamente a 37 graus Celsius por 48 horas.
Para o pré-inóculo use um lubrificante esterilizado para colher 10 colônias de albicanos candida dos pratos petri e colocá-los em um tubo de centrífuga contendo 10 mililitros de meio YNB, complementados com glicose. Incubar o tubo aerobicamente a 37 graus Celsius durante 16 horas. Em seguida, prepare o inóculo adicionando esta cultura inicial em meio YNB fresco, suplementado com glicose, em uma proporção de um a 10 para diluição.
Use o espectótmetro para medir o OD inicial em 540 nanômetros. Incubar os inóculos aerobicamente a 37 graus Celsius por oito horas, e medir o OD final em 540 nanômetros. Subtraia o OD final do OD inicial para verificar se o OD dos inóculos está na fase de crescimento do registro médio.
Para obter um inóculo com 10 a sete células por mililitro, centrífugo o inóculo por cinco minutos a 5.500 vezes G.Despeje o sobrenatante em um béquer contendo hipoclorito de sódio e adicione ynb fresco para concentrar o inóculo à metade do volume anterior. Adicione um mililitro do inóculo a cada poço de uma placa de poliestireno de 24 poços. Incubar aeróbicamente a 37 graus Celsius por 90 minutos para permitir a adesão celular ao fundo dos poços.
Trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de 0,12% de clorexidina para os biofilmes de controle positivo. Para o controle negativo, trate os biofilmes por um minuto com um mililitro de cloreto de sódio estéril e 0,89%. Posteriormente, lave os poços duas vezes, um minuto cada, com um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% para remover células não aderentes.
Em seguida, ligue uma luz vermelha não coerente e use um medidor de energia para medir a densidade de energia da luz. Determine o tempo de exposição com base na exigência de densidade energética de 87,6 joules por centímetro quadrado. Coloque a placa sob a luz vermelha.
Mantenha a distância entre a fonte de luz e o biofilme para cinco mililitros para evitar o aquecimento da amostra. Após a exposição por um minuto, adicione um mililitro do meio RPMI esterilizado a cada poço, e incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Pela manhã, repita a mesma lavagem, tratamento leve, tratamentos de controle positivo e negativo e incubação por seis horas com meio RPMI.
Novamente, lave os biofilmes duas vezes, exponha-os à luz vermelha e realize tratamentos de controle positivos e negativos. Aspire a solução nos poços e adicione meio RPMI. Repita a incubação, lavagem, tratamento leve e tratamentos de controle positivos e negativos, até alcançar 48 horas de desenvolvimento de biofilme.
Para iniciar o processamento, descarte o meio e adicione um mililitro de cloreto de sódio estéril, 0,89% ao poço, e use uma ponta de pipeta para riscar o biofilme do poço. Transfira o biofilme removido para um tubo estéril. Adicione mais um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,89% ao poço.
Arranhe-o novamente e adicione a suspensão ao mesmo tubo, para um volume total de 2 mililitros. Vigorosamente vórtice a suspensão do biofilme por um minuto. Para análise da UFC, transfira uma alíquota de 0,1 mililitros da suspensão do biofilme para um tubo de micro centrífugas contendo 900 microliters de solução de cloreto de sódio de 0,89% para cada diluição.
Diluir a solução de biofilme de 10 para a negativa, para 10 para as quatro negativas, em solução salina. Semente 50 microliters de cada diluição em placas SDA, e incubar as placas a 37 graus Celsius por 48 horas. Conte as colônias e aplique a fórmula.
Para análise de peso seco, primeiro pesar e rotular tubos micro centrífugas. Adicione 0,1 mililitros da suspensão do biofilme e um mililitro de etanol absoluto nos tubos, e armazene-os a 20 graus Celsius negativos por 18 horas. Então, centrifuá-lo 10.000 vezes G por 10 minutos.
Descarte o supernatante e coloque os tubos em um desiccador para secar as amostras por uma semana. Pesar os tubos de micro centrífugas novamente, e fazer a subtração para obter o peso da biomassa. Neste experimento, após tratamentos por diem com luz vermelha por um minuto para os biofilmes candida albicans, a UFC foi reduzida, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.
Os desfechos da biomassa dos biofilmes candida albicanos após os tratamentos diários, mostram que o grupo tratado de luz vermelha apresentou redução similar da biomassa à observada no grupo controle positivo, tratado com clorexidina. Os dois grupos também apresentaram semelhança estatística entre si. Embora ambos tenham apresentado redução da biomassa, em comparação com o controle negativo tratado com cloreto de sódio.
Quantidades inferiores de Cândidas albicans solúveis e insolúveis EPS, observou-se em controle positivo, em comparação com o controle negativo. Embora não estatisticamente significante, a aplicação por diem de luz vermelha diminuiu numericamente as quantidades de EPS solúvel e EPS insolúvel. O controle negativo e o grupo tratado da luz vermelha apresentaram semelhança estatística.
Medindo a densidade de energia da luz, usando um medidor de energia antes de iniciar o tratamento para determinar os períodos exatos de aplicação. As etapas garantem que a densidade de energia será sempre de 87,6 joules por centímetros quadrados. Use a fórmula citada anteriormente.
A medição é feita utilizando o mesmo da luz para a garrafa das placas, cinco milímetros. Uma associação entre fototerapia e drogas antifúngicas pode ser estudada para verificar se o pré-tratamento com luz vermelha, seguido pela aplicação de drogas, melhora a penetração de drogas no biofilme. Para o tratamento duas vezes ao dia, adaptamos os protocolos do nosso laboratório, fornecendo um modelo de biofilme fácil e reprodutível, que fornece respostas sobre viabilidade, peso seco e quantidades de polissacarídeo extracelular após o tratamento da luz vermelha.
O protocolo é genérico e pode ser usado para testar outras terapias, além da luz vermelha, incluindo drogas, outras luzes, ou a combinação de luz e drogas. Trabalhar com microrganismos requer equipamentos especiais, como óculos de segurança, jaleco de botão e luvas de nitro.
