Este estudo é um sistema simples, versátil e fácil de examinar diferentes efeitos fotodinâmicos em vários microrganismos e células. Neste sistema, o LED pode ser encaixado em diferentes arranjos, dependendo do design do experimento. Diferentes condições de PDT podem ser computadas em uma placa de 96 poços ou até mesmo uma placa de 384 poços em um experimento.
Essa técnica pode ser usada para tratar a ceratite fúngica, pois globalmente, cerca de 150.000 pessoas perdem os olhos apesar dos tratamentos intensivos. Para começar, corte quatro LEDs verdes de uma tira led e alinhe-os com três poços de uma placa de 96 poços. Meça a taxa de fluência do LED em 540 nanômetros com um medidor de energia leve.
Mantenha a temperatura constante a 25 graus Celsius com um ventilador elétrico que foi montado ao lado da placa durante a irradiação. Com um laço estéril, escolha uma única colônia de albicanos candida de uma placa de ágar e adicione-o a um tubo de vidro esterilizado contendo três mililitros de meio YPD. Incubar o tubo a 25 graus Celsius a uma velocidade de rotação de 155 RPM por 14 a 16 horas para crescer a cultura da levedura.
Em seguida, diluir a cultura da noite para o dia com o meio YPD para um valor de 600 OD de 0,5. Incubar a 30 graus Celsius com rotação a 155 RPM por quatro horas para alcançar a fase de crescimento do tronco. Repita a diluição da cultura da fase de registro com um meio YPD fresco a um valor de 600 OD de 0,65, para obter aproximadamente uma vezes 10 para a sétima colônia formando unidades por mililitro.
Prepare simultaneamente uma solução de estoque de 4% de rose bengala em 1X PBS. O filtro esterilizar com um filtro de 0,22 micrômetro. Adicione 111 microliters de 2% de solução de bengala rosa a um mililitro da cultura da fase de registro, e co-cultura em diferentes pontos de tempo à temperatura ambiente para entender a absorção de RB nas células.
Centrifugar a 16, 100 vezes G por 2 minutos e meio em temperatura ambiente, e lavar a co-cultura três vezes com um mililitro de 1X PBS. Após a lavagem, resuspenha a cultura candida albicans em um mililitro de 1X PBS. Para cada condição, distribua a cultura em três poços diferentes em uma placa de 96 poços.
Alinhe os poços com o array LED. Nos grupos expostos à luz, ligue o ventilador elétrico e a luz. Após a irradiação, realize diluições seriais dez vezes, pegando 20 microliters da solução de cocultura de um poço, e adicionando-a a um tubo contendo 180 microliters de 1X PBS.
Em seguida, solte 20 microliters de cada diluição serial em um quadrante de uma placa de ágar YPD para obter colônias contáveis na placa. A microscopia fluorescente mostrou coloração imediata de candidanos albicanos com bengala rosa sob fluorescência vermelha. Após 15 minutos de incubação, a maioria das células foram manchadas com bengala rosa, indicando que ela entra nas células de forma dependente do tempo.
Além disso, a ativação da bengala rosa com luz gera radicais livres e oxigênio único nas células, resultando em morte celular. Na ausência de bengala-rosa ou irradiação, não foi observada morte celular. A candida albicans foi inibida após a irradiação da luz verde na presença de 0,2% de bengala rosa de forma dependente de dose leve.
É importante que primeiro a placa de 96 poços esteja alinhada com o centro do LED. Em segundo lugar, a placa de ágar utilizada deve ser completamente seca para evitar a mistura de colônias separadas. Os albicanos candida que cresceram na placa podem ser enviados para análise genética, o que pode responder como o PDT afeta a expressão genética das células.
Essas técnicas abrem caminho para examinar como o PDT funciona em diferentes tipos de células, sejam células cancerosas, bactérias, fungos ou vírus com uma plataforma fácil, barata e versátil.
