Os autores querem agradecer aos membros do passado e presente na Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratórios para o desenvolvimento de técnicas de genética e reverter influenza plasmídeos. Pesquisa em laboratórios AG-S é parcialmente financiado pelo CRIP, um Centro de NIAID-financiado de Excelência para Pesquisa e Vigilância da Influenza (HHSN266200700010C) e por doações NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. Pesquisa em LM-S laboratório é parcialmente financiado pelo NIAID conceder RO1AI077719.

1. Influenza transfecção de resgate de vírus Vírus influenza A pertence à família Orthomyxoviridae de vírus de RNA de fita negativa envolvido. A influenza A genoma do vírus é composto por oito genes diferentes de RNA de polaridade negativa que codificam, pelo menos, 11 proteínas virais (Figura 1) 4. Vamos nos concentrar, neste relatório, sobre o resgate de um dos cepa de laboratório mais comum, a influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmídeos ambisense (PDZ), contendo os 8 influenza A/PR/8/34 segmentos viral ( Figura 2). Para o resgate de vírus de influenza recombinante de DNA plasmídeo, recomendamos 3 transfections independentes por cada vírus recombinante. Se mais de um resgate vírus recombinante é tentada, escala os seguintes passos accordantly ao número de vírus para ser resgatado. A transfecção seguinte e protocolo de infecção é estabelecida para 6-bem-pratos. Uma representação esquemática do protocolo é ilustrada na Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mistura: Prepare 250 L de mídia OptiMEM e 6-8 mL de LPF2000 por transfecção. Incubar por 5-10 minutos em temperatura ambiente (RT). Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção do plasmídeo. </li><li> Mistura de transfecção do plasmídeo: Prepare o coquetel de transfecção do plasmídeo em 50 ul de mídia OptiMEM. Nós usamos geralmente 1 mg de cada DNA influenza plasmídeo por socorro. Adicionar 1 ml de os plasmídeos PDZ (a 1 mg / mL) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS para um tubo contendo 50 mL dos meios de comunicação OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA plasmídeo mistura: Adicionar 250 L a partir do passo 1,1 na mistura de transfecção influenza DNA plasmídeo (passo 1.2). Incubar a mistura por 20-30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, preparar suspensões de células MDCK 293T e de transfecção. </li><li> Preparação de 293T/MDCK co-cultura: Antes de começar, trazer a 1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS mídia e EDTA-tripsina mistura a 37 ° C. A densidade das células deve ser a confluência de 80-90% no dia da transfecção. Geralmente, um prato milímetros confluentes 100 de 293T e um prato milímetros confluentes 100 de células MDCK pode ser usado por 10-12 resgates. Nós vamos usar 250 L de células por poço. Ambas as linhas de células será ressuspenso em um total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%. <ul><li> Ressuspender cuidadosamente cada linha de células em 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% em um tubo de centrifugação de 15 ml. Você terá um tubo de células 293T e um tubo de células MDCK. </li><li> Ressuspender as células 293T em 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% e quando ressuspenso, entregar a 3 ml para as células MDCK para ressuspender as células. Isto lhe dará a mistura de células MDCK 293T e para ser usado para o seu co-cultura. </li><li> Adicionar 250 mL das células 293T/MDCK por poço (10-12 junho bem-poços). </li></ul></li><li> Após 20-30 minutos de incubação RT (passo 1.3), adicionar 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% para a mistura de DNA OptiMEM-LPF2000-influenza plasmídeo. </li><li> Adicione o ml 1.3 (passo 1.5) para os poços com a 250 mL de células 293T/MDCK (passo 1.4). </li><li> Agite suavemente o 6-bem-placa e deixar a incubar transfecção overnight (ON) na incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. </li><li> No dia seguinte, cerca de 16-24 horas após a transfecção, alterar a mídia de transfecção e incubar as células transfectadas em DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina por 48 horas. </li><li> Após 48 horas de mudar a mídia, transferir o sobrenadante das células transfectadas em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar o sobrenadante de cultura de tecidos em microcentrífuga por 1-2 minutos, 13.000 rpm. </li><li> Infectar novas células MDCK em 6 bem-placas (banhado no dia anterior) ou ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha com 200 mL do sobrenadante centrifugado cultura de tecidos a partir do passo 1.10. Incubar as células e / ou ovos a 37 ° C por 2-3 dias. <ol><li> Infecção de ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha: Todos os procedimentos para infectar os ovos de galinha embrionados são realizados em condições estéreis. <ol><li> Vela os ovos de 10 dias de idade, usando uma caixa de luz candling para ver a interface entre o saco de ar e na cavidade alantóide. Faça uma marca de lápis na fronteira interface. </li><li> Com uma agulha de seringa de 5 ml fazer um buraco na casca de ovo. </li><li> Com uma seringa de 1 ml, infectar cada ovo com 200 mL do sobrenadante de cultura de tecidos a partir do passo 1.10. </li><li> Cobrir o buraco na casca de ovo com cera derretida usando um cotonete. </li><li> Incubar os ovos infectados em 37οC por 2-3 dias. </li></ol></li><li> Infecção de novas células MDCK: O dia antes da passagem do sobrenadante de cultura de tecidos a partir da 293T/MDCK co-culturas, prépare de 6 pratos bem placa com células MDCK para alcançar confluência de 80-90% no dia seguinte. Geralmente, um confluentes 100 milímetros placa de cultura de tecidos pode ser dividida em 6-8 poços. Lavar as células, duas vezes, com PBS 1X, trypsinize e preparar as placas de 6 poços. Agite suavemente com a mão as placas, a fim de ter uma distribuição uniforme das células. Cultura das células, ON, na 37 ° C incubadora, 5% CO 2. Antes da infecção, verifique as células ao microscópio para confirmar uma monocamada, então, prosseguir com a infecção: <ul><li> Lave as células, duas vezes, com 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infectar com o 200 mL do sobrenadante da cultura de tecidos centrifugada por 1 hora em temperatura ambiente. Não deixe que as células secas. Rock the 6-bem-placa a cada 10 minutos. </li><li> Após uma hora de absorção viral, remova a mídia infecção das células MDCK e adicionar 2 ml de DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina. </li><li> Em 48-72 horas após a passagem, dependendo da eficiência de transfecção e da carga de vírus, um efeito citopático (CPE) será observado nas células MDCK infectados. CPE sugere um resgate bem sucedido. No entanto, um ensaio HA (seção 2) deve ainda ser realizados para confirmar a presença do vírus no sobrenadante de cultura de tecidos. </li></ul></li></ol></li><li> Colheita de fluido alantóide de ovos embrionados de galinha infectados: Todos os procedimentos para colher o fluido alantóide de ovos infectados são realizados em condições estéreis. Cerca de 8-12 ml de líquido alantóico podem ser colhidos de cada ovo de 10 dias de idade infectadas. Antes da colheita do líquido alantóico, incubar os ovos de galinha para 2 horas (ou ON) a 4 ° C para matar o embrião de galinha e coagular o sangue. <ul><li> Lavar os ovos com etanol 70% para estabelecer condições estéreis. </li><li> Abra o ovo, com cuidado, sobre a cavidade do ar batendo com uma colher. Remova a casca quebrada com a ajuda de fórceps. </li><li> Com uma agulha de 1 ml, retire a membrana alantóide, sem quebrar a gema do ovo. </li><li> Estabilizar o embrião de galinha com uma espátula como você guia uma pipeta de 10 ml para o líquido alantóide. Recolher o líquido alantóico tanto quanto possível, em um tubo de centrífuga de 15 ml de gelo em um balde de gelo sem quebrar ou recolher qualquer gema do ovo. Use um tubo de centrifugação de 15 ml para cada ovo. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C e transferir o líquido alantóico (sem ter peletizada células vermelhas do sangue) para um novo 15 tubos de centrífuga ml. </li><li> Armazenar os tubos contendo o líquido alantóide centrifugadas a 4 ° C até que eles são verificados para a presença do vírus resgatado com um ensaio de hemaglutinação (HA). </li></ul></li></ol> 2. HA ensaio para confirmar o resgate de vírus influenza recombinantes Ensaio de hemaglutinação (HA) é rotineiramente usado para detectar a presença do vírus resgatados em sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou o fluido alantóide de ovos colhidos. Alternativamente, imunofluorescência (IFA) também pode ser realizada. Uma vez um ensaio identifica a presença do vírus resgatado, o vírus deve ser purificado e placa a composição genética do vírus será confirmada por RT-PCR e seqüenciamento. A presença do vírus no tecido MDCK sobrenadantes de cultura e / ou no fluido alantóide de ovos infectados pode ser determinada macroscopicamente usando HA de frango (ou outra fonte) glóbulos vermelhos (RBC). A presença do vírus induz a hemaglutinação da RBC, enquanto a ausência de vírus permite a formação de uma pelota vermelha no fundo do poço (Figura 4). No caso do vírus da gripe, acredita-se que cerca de 10 3 -10 4 unidades formadoras de placa (UFP) são obrigados a dar um sinal positivo no teste de HA e, portanto, um IFA pode ser realizada em paralelo com o ensaio de HA para confirmar um resultado verdadeiro negativo. IFA com primário anti-influenza anticorpos é mais sensível que o ensaio HA porque menos de 103-104 vírus podem ser detectados com esta técnica. É possível que sobrenadantes ou líquidos alantóide que são HA-negativos são positivos pelo IFA. Neste caso, o vírus deve ser amplificada por passaging, novamente, em células MDCK ou em ovos. Líquido alantóico e / ou sobrenadantes de cultura de tecidos a partir da segunda passagem deve agora ser claramente positivo no ensaio HA. HA ensaios são realizados em placas de 96 poços V-bottom. Negativo (por exemplo, PBS 1X) e positivo (sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico de uma infecção pelo vírus influenza) amostras de controle deve sempre ser incluídos em qualquer ensaio de HA para validá-lo. <ul><li> Dispensar 50 ul de PBS 1X em cada poço da V bottom-96 poços da placa. </li><li> Adicionar 50 ul deos sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou líquido alantóico dos ovos infectados para o primeiro poço e, fazer 2 diluições de série para os poços seguinte. Descartar a 50 mL extra do bem passado. </li><li> Adicionar 50 ul de 0,5% -1,0% frango células vermelhas do sangue (preparado em PBS 1X) a cada poço. </li><li> Incubar a V-bottom 96 poços da placa por 30-45 minutos (até um ponto vermelho é visível na parte inferior de uma amostra de controlo negativo PBS) no gelo. Ler e interpretar os resultados, conforme indicado na Figura 4. </li></ul> 3. Passagem de sobrenadantes de cultura de tecidos Um resultado negativo no ensaio de HA pode ser um resultado da eficiência de transfecção baixa com baixos níveis de vírus presente estar no sobrenadantes de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico. Passagem destas amostras em ovos frescos MDCK e / ou embrionados permitirá a amplificação do vírus (como indicado na Figura 3) As infecções são realizados conforme descrito anteriormente na seção 1.11.2. 4. Resultados representante Resgate de vírus influenza sucesso será confirmada pela presença de um ensaio de HA positivo (Figura 4). Além disso, a existência de CPE em células infectadas com o sobrenadante de cultura de tecido ou com o fluido alantóide de ovos irá sugerir um resgate positivo viral. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Influenza estrutura Virus: vírus Influenza é cercada por uma bicamada lipídica que contém as duas glicoproteínas viral (HA, NA) e, também, a proteína canal iônico, M2. HA é a proteína viral anexo, responsável pela ligação com ácido siálico contendo receptores. NA é responsável pela libertação viral a partir de células hospedeiras. Debaixo da bicamada lipídica, é uma camada de proteína composta pelo interior de proteínas da matriz superfície do envelope 1, M1, que desempenha um papel no virion montagem e brotamento ea proteína nuclear de exportação (NEP), exigido para a exportação nuclear da ribonucleocapsids viral. O núcleo do vírus é feita de um complexo ribonucleoproteína (RNP), composto de 8 de single-stranded RNA viral negativa genes encapsidated pela nucleoproteína viral, NP. Associadas com o complexo RNP são as viral RNA polimerase dependente de RNA subunidades PA, PB1, PB2 e. As proteínas não estruturais NS1 e PB1-F2, codificada pelos segmentos de RNA NS e PB1, respectivamente, não são parte da estrutura do virion. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Plasmídeos de resgate de vírus influenza: A oito genes da influenza vírus clonados no PDZ ambisense plasmídeo são indicados. PDZ plasmídeo 6, derivado da expressão da proteína plasmídeo pCAGGs 7, é um vetor plasmídeo bidirecional com uma RNA polimerase humana Eu promotor e um rato uma sequência de terminador que codifica o RNA genômico sentido negativo, em orientação oposta à polimerase I unir, uma polimerase II cassete de transcrição (promotor de frango β-actina e poli) codifica as proteínas virais do mesmo gene viral. cDNAs de cada segmento viral são gerados por RT-PCR com primers frente e verso contendo o Sapi site de endonuclease de restrição e as regiões não-codificadoras de cada segmento (caixas-pretas no final dos genes virais). O produto da PCR é clonado no PDZ digerido com Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Oito plasmídeo baseado em sistema de resgate influenza: PDZ plasmídeos contendo os genes 8 influenza viral são co-transfectadas, em suspensão, em 293T-MDCK células co-culturas (dia 1). Vinte e quatro horas após a transfecção, mídia sem FBS, mas contendo TPCK / tripsina é substituído (dia 2). Quarenta e oito horas após mudar a mídia, o sobrenadante de cultura de tecidos é colhida e utilizada para infectar células MDCK ou 10 dias de idade, ovos de galinha embrionados (dia 4). 48-72 horas pós-amplificação, sobrenadantes de cultura de tecidos de células infectadas ou MDCK líquido alantóico de ovos são colhidas e analisadas para a presença do vírus por HA (dia 6). Se nenhum vírus é detectado, os sobrenadantes mesmo e / ou líquidos alantóico podem ser re-frescos várias passagens em células MDCK e / ou ovos embrionados. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Hemaglutinina ensaio (HA): Hemaglutinação da RBC por partícula do vírus é visível macroscopicamente e é a base para detectar partículas virais em sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquidos alantóide. Embora o ensaio de HA não discrimina entre as partículas virais que são infecciosas e partículas que estão degradadas e não é capaz de infectar as células, o ensaio é um bom indicador da presença de vírus em amostras. A) Ausência (parte superior) da presença (em baixo) do vírus nas amostras biológicas é determinado pela presença de glóbulos vermelhos no fundo do prato ou a sua ausência, respectively. B) Um resultado representante de um ensaio HA sem níveis detectáveis ​​de vírus (superior) ou presença (parte inferior) do vírus é mostrado.

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai School of Medicine tem direitos de propriedade intelectual na área de vírus influenza recombinante, e AG-S é um inventor nesta propriedade intelectual.

Resgate de vírus influenza recombinante de DNA plasmídeo é um processo simples e direta uma vez que o protocolo é realizada rotineiramente no laboratório, mas no início, várias coisas podem dar errado. É imperativo ter boa preparação plasmídeo para gerar o vírus. Manutenção adequada das linhas celulares (293T e MDCK) é crucial para um resgate bem sucedido viral. Tradicionalmente, uma marca genética é inserido em um gene que codifica a gripe-plasmídeo, por mutagênese em silêncio. Introdução desta mu...

Linhagens de células 293T (número de catálogo CRL-11268) e MDCK (número de catálogo CCL-34) linhas celulares são mantidos em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2 em DMEM 10% FBS, PS 1%. Células são formulário disponível a Coleção American Type Culture (ATCC, 10.801 University Boulevard Manassas, VA. 20110-2209 EUA). Ovos de galinha embrionados Embrionados ovos de 10 dias de idade de frango pode ser obtido a partir de Charles River Laboratories, Abastecimento aviária Specific Pathogen Fee (SPAFAS) Produtos e Serviços aviária. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 EUA. Os ovos são incubados a 37 ° C antes e após a infecção viral. Antes e após a infecção viral, os ovos são candled para determinar a viabilidade dos embriões. É muito importante olhar para os ovos mortos antes e após a infecção viral. Antes da infecção um ovo de mortos pode ser facilmente localizados pela ausência de vasos sanguíneos, bem como a ausência de mobilidade do embrião. Quando candled, embriões vivos movimento. Após a infecção viral um ovo morto (provavelmente relacionado à infecção pelo vírus influenza) vai ser facilmente localizados pela aparência ruim do ovo como visto pelo volume menor e mais sangrenta de líquido alantóico. Infectados de ovos são descartadas em dois sacos autoclaváveis ​​e autoclavada seguintes procedimentos padrão. Células vermelhas do sangue de galinha (RBC) Chicken RBC pode ser comprado de Fazendas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21.620. Armazenar a 4 ° C. Para ensaios de HA, lavar 5 ml da RBC frango com 45 ml de PBS 1X em um tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpms, RT. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e use uma diluição 1:1000 da RBC peletizada em PBS 1X (concentração final de RBC 0,5-1,0%). Sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóide Ambos, sobrenadantes de cultura de tecidos e fluidos alantóico podem ser armazenados a 4 ° C por um curto período de tempo. Após a confirmação de resgate de vírus, vírus de sobrenadantes de células ou líquido alantóico são armazenadas a -80 ° C. Plasmídeos Todos os plasmídeos são preparadas usando um plasmídeo recomendações maxi fabricante seguinte kit. Todos os plasmídeos são alíquota em concentrações de 1 mg / ml em DDH 2 O e armazenadas a -20 ° C. De curto prazo de armazenamento, o plasmídeo pode ser manter a 4 ° C. A concentração do DNA purificado plasmídeo é determinado por espectrofotometria a 260 nm, com pureza de ser estimada utilizando a proporção nm 260:280. Preparações com 1,8-2,0 nm 260:280 índices são considerados apropriados para fins de resgate de vírus. Além disso, concentração e pureza plasmídeo devem ser confirmados com agarose gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmídeos (6) contendo os oito genes da influenza A/PR/8/34 viral (7) são ilustrados na Figura 2. Vírus O protocolo descrito de emergência da gripe A/PR/8/34 pode ser realizada sob nível de biossegurança (BSL) 2 condições. Material contaminado, incluindo sobrenadantes de cultura de tecidos e ovos embrionados, devem ser esterilizados antes da eliminação. Resgate de vírus da gripe pode exigir outras condições BSL maior e, portanto, condições especiais / medidas de segurança terão de ser seguidas. Tecido meios de cultura e soluções DMEM 10% FBS PS 1%: 445 ml meio modificado Dulbecco Águia (DMEM), 50 ml de soro fetal bovino (FBS), e 5 ml de 100X Penicilina / Estreptomicina (PS). Armazenar a 4 ° C. Essa mídia será usada para manter as células MDCK e 293T, bem como para a transfections. DMEM BA 0,3% a 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albumina bovina (BA). Armazenar a 4 ° C. Pouco antes de usar, adicione TPCK tripsina tratada para uma concentração final de 1 mg / ml. Media infecciosas. Fosfato 10X solução salina tamponada (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Adicionar DDH 2 O até 1 litro. Ajustar o pH para 7,3. Esterilizar em autoclave. Conservar à temperatura ambiente. 1X PBS: Diluir 1:10 com PBS 10X DDH 2 O. Esterilizar em autoclave e armazenar em temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Esforços por um número de grupos de pesquisa da gripe têm sido fundamental no desenvolvimento e melhoria da influenza A genética reversa do vírus. Originalmente estabelecida em 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmídeo baseado em técnicas de genética reversa para gerar vírus recombinante revolucionaram o campo de pesquisa da gripe, porque determinadas questões foram respondidas por engenharia genética, infecciosa, vírus da influenza recombinante. Esses estudos incluem a replicação do vírus, a função de proteínas virais, a contribuição de mutações específicas em proteínas virais na replicação viral e / ou patogênese e, também, vetores virais usando vírus influenza recombinantes expressando proteínas estranhas<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.1K visualizações.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...