O uso de vírus recombinantes é uma tecnologia poderosa tanto para decifrar os mecanismos de replicação viral quanto para fornecer plataformas de desenvolvimento para vacinas. Da mesma forma, a geração de estoque viral de boa qualidade é crucial para todos os estudos virais desde a pesquisa mais fundamental até os estudos aplicados. O resgate de vírus recombinantes, a colheita, o congelamento e a titulação dos estoques de RSV são métodos críticos para todos os estudos virológicos.
Eles podem ser considerados tradicionais, mas permanecem delicados e requerem especialização específica. Um dia antes da transfecção, suspenda as células BSR-T7/5 em meio completo a 0,5 milhões de células por concentração mililitro. Distribua dois mililitros da suspensão da célula por poço em uma placa de seis poços.
Incubar a placa a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% até atingir 80-90% de confluência no dia seguinte. Para resgatar cada vírus, primeiro misture vetores de genética reversa descongelados em um tubo, depois proceder à transfecção, seguindo o protocolo do fabricante do reagente de transfecção. Em seguida, adicione 250 microliters do meio sérico reduzido aos vetores mistos.
Em outro tubo, diluir 10 microlitres deste reagente de transfecção em 250 microliters do meio soro reduzido. Bata suavemente os dois tubos e espere por cinco minutos. Misture o conteúdo de ambos os tubos e espere 20 minutos em temperatura ambiente.
Enquanto isso, enxágue as células BSR-T7/5 com um mililitro do meio sérico reduzido e distribua 1,5 mililitro de antibióticos de mídia essenciais mínimos complementados com soro de bezerro fetal de 10% por poço. Se necessário, incubar a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5%. Após a incubação de 20 minutos, adicione 500 microliters da mistura de transfecção em cada poço.
Incubar as células a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% por três dias. Para monitorar a eficiência de resgate, observe a fluorescência GFP sob um microscópio de fluorescência invertida a 20X de ampliação uma vez por dia. No terceiro dia de transfecção, arranhe células em cada poço da placa de seis poços BSR-T7/5 transfeccionada.
Transfira células e supernascer de cada poço em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros estéreis. Para liberar o vírus resgatado das membranas celulares, vórtice cada tubo vigorosamente por pelo menos 30 segundos. Para a primeira amplificação dos vírus resgatados, primeiro remova o meio de cultura da placa HEp-2 semeada no dia anterior, depois adicione rapidamente 500 microlitros por poço da suspensão viral de passagem fresca-zero.
Coloque a placa HEp-2 a 37 graus Celsius em um roqueiro de gangorra para agitação suave por duas horas. Para produzir a primeira passagem dos vírus resgatados, descarte 500 microliters do inóculo e adicione dois mililitros de MEM com 2% de FCS. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três dias.
Para monitorar a infecção sob um microscópio de fluorescência invertida na ampliação de 20X, observe a fluorescência GFP das células HEp-2 infectadas com a suspensão de passagem zero uma vez por dia. Sob um microscópio de campo brilhante, observe a aparência de pequena sincronia e descolamento celular, o que reflete o efeito citopático RSV. Para amplificar os vírus resgatados, primeiro dilua a suspensão viral do MEM livre de FCS para obter uma suspensão de três mililitros a 50.000 PFU por mililitro, em seguida, remova o meio do frasco HEp-2.
Adicione rapidamente a suspensão viral de três mililitros e incubar o frasco a 37 graus Celsius em um roqueiro de gangorra para agitação suave por duas horas. Em seguida, remova e descarte o inóculo e adicione 15 mililitros de MEM com 2%de FCS. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias.
Para estimar o momento certo para colher os vírus, verifique a morfologia celular e a fluorescência GFP sob um microscópio de fluorescência invertida na ampliação de 20X. Observe que isso ocorre geralmente quando 50% a 80% da camada celular HEp-2 é destacada devido ao efeito citopático RSV que ocorre entre 48 e 72 horas após a infecção. Em seguida, raspe todas as células usando um raspador de células.
Colete as células e o supernatante juntos e transfira-as para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Adicione 1/10 do volume da solução de conservação 10X RSV. Vórtice os tubos vigorosamente por cinco segundos e centrífuga por cinco minutos a 200 vezes g para esclarecer a suspensão.
Transfira o supernatante para um tubo de 50 mililitros. Vórtice brevemente e alíquota a suspensão em tubos criogênicos rotulados com etiquetas resistentes ao álcool. Mergulhe o tubo em álcool pré-resfriado, menos 80 graus Celsius por pelo menos uma hora e armazene-os a menos 80 graus Celsius.
Para realizar um ensaio de titulação de placa, primeiro faça 2X meio essencial mínimo diluindo o MD MEM comercial 10X com água estéril e adicionando L-glutamina, 1.000 unidades por penicilina mililitro, e um miligrama por estreptomicina mililitro. Agite a diluição vigorosamente e armazene-a a quatro graus Celsius, depois adicione 900 microliters do MEM livre de FCS a seis tubos. Descongele as alíquotas do vírus e o vórtice vigorosamente por cinco segundos.
Para fazer diluições seriais, adicione primeiro 100 microliters do vírus a 900 microliters do meio no primeiro tubo. Coloque a tampa no tubo e misture seu conteúdo por vórtice por alguns segundos, depois adicione 100 microliters da primeira diluição a 900 microliters do meio no segundo tubo. Coloque a tampa no tubo e o vórtice.
Repita este procedimento até o sexto tubo. Escreva o nome do vírus e as diluições completas nas placas HEp-2 12-well. Adicione uma marca para combinar com a placa e sua tampa, pois elas podem ser separadas durante a coloração.
Retire o meio das placas e distribua 400 microliters de uma diluição por poço. Incubar as placas a 37 graus Celsius por duas horas para adsorção de vírus. Durante a adsorção do vírus, prepare a sobreposição de celulose microcristalina ajustando primeiro o pH do MEM 2X para cerca de 7,2 com uma solução de bicarbonato de sódio estéril em 7,5% seguindo o indicador de cor.
Para obter 100 mililitros da sobreposição, adicione 10 mililitros de 2X MEM, 10 mililitros de 2,4% de suspensão de celulose monocristalino e 80 mililitros do MEM complementados com 2% de FCS e misture vigorosamente. No final da incubação de duas horas, adicione dois a três mililitros da sobreposição a cada poço das placas de 12 poços sem remover o inóculo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por seis dias.
Para colorir as células com solução violeta cristalina, primeiro agite suavemente as placas para tirar a sobreposição de celulose microcristalina. Remova os supernacantes e lave as células duas vezes com 1X PBS, em seguida, adicione um a dois mililitros da solução violeta cristalina e espere de 10 a 15 minutos. Remova a solução, que pode ser reutilizada para posterior coloração da placa.
Finalmente calcule os tituladores do vírus como uma fração do número de placas visíveis nos poços das placas secas e do volume do inóculo e da diluição. Realizando um ensaio de placa sobre o controle negativo, transfectados apenas com a expressão plasmídeos de N, P, L e M2-1 não revelou nenhuma placa na diluição mais baixa. Esperava-se que os títulos obtidos das células transfeinadas fossem acima de 100 PFU por mililitro se o resgate fosse eficiente.
Os títulos aumentaram ao longo das passagens para atingir um milhão a 10 milhões de PFU por mililitro na passagem um ou dois. Graças a esses vírus fluorescentes, a inibição da expressão RSV pelo siRNA visando a proteína N e a proteína celular IMPDH pode ser facilmente observada e medida. Em contraste, um forte sinal de GFP em células de controle transfeinadas com siRNA não direcionado ou células transfectadas com siRNA contra a proteína celular GAPDH foi observado e medido.
Da mesma forma, esses vírus permitiram a fácil observação da inibição da multiplicação de RSV por um composto antiviral. O rastreamento da proteína fluorescente M2-1 em células infectadas por HEp-2 mostrou os IBs e grânulos associados ao IB como estruturas muito dinâmicas. Os IBs foram observados como estruturas móveis e esféricas capazes de fundir e formar maiores inclusões esféricas.
Os grânulos associados ao IB foram submetidos a ciclos contínuos de desmontagem de montagem com a formação de pequenos grânulos associados ao IB que cresceram, fundiram-se em grandes grânulos associados ao IB e desapareceram. O protocolo de titulação de placa de RSV usando sobreposição de celulose microcristalina pode ser facilmente adaptado a outras células e/ou outros vírus. Exigirá ajuste da concentração da celulose microcristalino.
