Veja a Figura 1 para uma ilustração resumindo o seguinte protocolo. Nota de segurança: Todo o material que tem estado em contacto com partículas virais montado precisa ser desinfetado com solução de Virkon ou desinfetante adequado. 1. Preparação de estoques de DNA plasmidial (~ 2 dias) <ol><li> Os plasmídeos são necessários os seguintes 1: <ul><li> pRV1 - Contendo a Rep AAV2 e seqüências de Cap </li><li> PH21 - Contendo a Rep AAV1 e seqüências de Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus helper-plasmídeo </li><li> AAV plasmídeo contendo o cassete de expressão recombinante ladeado por AAV2 sinais de embalagem (repete terminal invertido, ITRs) </li></ul></li><li> Enquanto pFdelta6 devem ser cultivadas em células Stbl2 competente para evitar a supressão parcial, e pRV1 PH21 podem ser cultivadas em células DH5alpha competente. Plasmídeos AAV podem ser cultivadas em células Stbl2 se deleções parciais ocorrem nas células DH5alpha. </li><li>Plasmídeo de DNA deve ser de alta qualidade e livre de contaminantes RNA. Plasmídeos podem ser rastreados para a integridade usando o seguinte digere: <ul><li> pRV1 - digerir com XbaI para dar as bandas de 7,5 kb e 3,8 kb </li><li> PH21 - digerir com EcoRI para dar as bandas de 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digerir com HindIII para dar as bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb e 1,5 kb </li></ul></li></ol> 2. Preparação de células embrionárias humanas Kidney 293 (Hek293) para transfecção (2-3 dias) <ol><li> Placa de duas 80% confluentes 150 centímetros dois frascos de células em cinco Hek293 15 centímetros de diâmetro Nunc placas de cultura de tecido. As células devem ser 70-80% confluentes antes de transfecção (aproximadamente 48 horas após o plaqueamento). Cultura em células modificadas padrão Dulbecco Águia (DMEM) com glicose baixa contendo 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> 3 horas antes de transfecção DMEM remover e substituir com Iscove&#39;Medium s modificado Dulbecco (IMDM) contendo 5% de soro fetal bovino. </li></ol> 3. Transfecção de plasmídeos viral (~ 1 hora para transfecção, 3 dias para incubação) <ol><li> Prepare o seguinte para um único lote (5 x 15 cm placas de cultura de tecido) do vírus: <ul><li> 62,5 mg AAV plasmídeo </li><li> 125 mcg pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg PH21 </li><li> 1650 mL 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> Em um filtro de tecido classe 2 capô cultura estéril a mistura de transfecção em um tubo de 50 ml. </li><li> Enquanto vórtex a solução, adicionar rapidamente 13 ml de 2 x HEPES solução salina tamponada (pH 7,05). Substituir a tampa do tubo de 50 ml e continuar a vortex por 15 segundos. Deixar repousar por 1 minuto 45 segundos, um precipitado branco fino deve formulário. </li><li> Delicadamente adicionar 5 ml da solução de transfecção para cada 15 centímetros placa de cultura de tecidos. Placas agite para misturar e voltar a incubadora. </li><li> 16 horas após a transfecção remova o meio de IMDM e substituir com DMEM. </li></ol> 4. Lise de células e colheita de rAAVs (2 horas) <ol><li> 72 horas após a transfecção, remova a mídia de placas de cultura de células e descarte. Todos os resíduos devem ser tratados com solução de Virkon ou desinfetante adequado. </li><li> Lavar cuidadosamente as células de fosfato de 1x quente solução salina tamponada (PBS, pH 7,4). </li><li> Adicionar 25 ml PBS quente para cada prato e retire cuidadosamente as células com um raspador de celular. Coletar suspensão em tubos de 50 ml. </li><li> Células pelota a 800 xg por 10 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e ressuspender pellet em 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, use 10 ml por placa de cultura de tecidos. Dividido em dois tubos de 50 ml. </li><li> Prepare uma nova solução de desoxicolato de sódio a 10% em dH 2 O. Adicionar 1,25 ml desta a cada tubo para uma concentração final de 0,5%. Adicionar benzonase nuclease a uma concentração final de 50 unidades por ml. Mix tubo completamente. </li><li&gt; Incubar a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Remover os restos celulares por centrifugação a 3000 xg durante 15 minutos. Transferir para tubo de 50 ml fresco, garantir que todos os restos celulares foi removido para evitar o bloqueio de colunas heparina (ver passo 5). Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C antes de continuar. Temos armazenado amostras por várias semanas a -20 ° C sem uma redução na infectividade. </li></ol> 5. Purificação coluna de heparina rAAVs (2-3 horas) <ol><li> Setup colunas HiTrap heparina usando uma bomba peristáltica para que as soluções de fluxo através da coluna a 1 ml por minuto para as etapas de 5,2-5,4. É importante garantir que não haja bolhas de ar são introduzidas na coluna de heparina. </li><li> Equilibrar a coluna com 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. </li><li> Aplicar solução de 50 ml de vírus para a coluna e deixar fluir. </li><li> Lavar coluna com 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. </li><li> Usando uma seringa de 5 ml continuar a lavar a coluna wom 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0. Descartar o escoamento. </li><li> Usando 5 ml seringas e eluir pressão suave o vírus da coluna através da aplicação: <ul><li> 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> Coletar esses em um tubo de centrifugação de 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. Concentração e de filtração estéril de rAAVs (1 hora) <ol><li> Concentre-se vetor usando Amicon ultra-centrífugas quatro unidades de filtro com um corte de peso molecular 100.000. Carga 4 ml de eluído no concentrador e centrifugar a 2000 xg por 2 minutos (em temperatura ambiente). Descartar fluxo contínuo e concentrador de recarga com solução vírus restantes e centrifugação repetir. O volume concentrado deve ser de aproximadamente 250 mL. Se o volume concentrado é significativamente mais do que isso, descarte o fluxo de through e continuar a centrífuga em um minuto, até que medidas de volume é de aproximadamente 250 mL. </li><li> Adicionar 250 mL de PBS ao vírus para um volume final de 500 mL e retire do concentrador. </li><li> Vector através de um filtro de 13 mm de diâmetro de filtro de seringa 0,2 mm. Vector deve ser aliquotado e estocado a -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 7. A titulação de ações viral (3 dias) Isso requer um promotor que é ativo em células Hek293 dirigindo um gene repórter ou um produto de gene immunocytochemically detectável. Ao produzir um vetor que não é compatível com células Hek293 outras linhagens celulares ou culturas celulares primárias podem ser usados. <ol><li> Prepare 18 poli-L-lisina lamínulas de vidro revestida ou 18 poços de slides câmara Nunc semeando Hek293 células para que eles sejam 40-50% confluentes. Para a titulação de Cre-dependente rAAVs uso Hek293 células que expressam estavelmente Cre recombinase 2. </li><li> Infectar cada poço com série dilutions do vetor AAV (Fig 2A). Use 3 poços por diluição. Rotineiramente adicionar vírus diretamente a cada poço. </li><li> Após 72 horas fixar Hek293 células adicionando um volume igual de paraformaldeído a 4% (PFA) e médio (dando uma concentração final de PFA 2%) para 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lavar celular três vezes em PBS, lavar em dH 2 O e lamela. </li><li> Contar o número de células transduzidas dos três poços que têm o maior fator de diluição, mas ainda contêm células infectadas, encontrar a média destes e multiplicar pelo fator de diluição para dar o número de unidades infecciosas por microlitro (Fig 2B). </li></ol> 8. Resultados antecipado Hek293 células transduzidas com uma codificação do vírus proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) são mostrados na Figura 2B. Em geral, alcançar títulos consistentes em torno de 6 x 10 6 partículas infecciosas por micro litro. Nós usam rotineiramente esses vetores para estereotáxica injection no cérebro de roedores adultos. Isto proporciona uma técnica poderosa para a região específica de expressão gênica 2. Para combinar esta especificidade região com células-tipo de expressão gênica seletiva injetamos Cre recombinase-dependente rAAVs em regiões alvo de Cre-camundongos transgênicos 2. Figura 2C-E mostra exemplos de injeções estereotáxica de Cre-dependente rAAVs codificação eGFP em diferentes regiões do cérebro de adultos parvalbumina-Cre camundongos transgênicos 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo para a produção rAAV. 1.) Hek293 células são banhados e cresceu para 70-80% confluência. 2.) Plasmídeos AAV e ajudante são preparados e transfectadas em células Hek293. 3.) Medium é alterado novamente para DMEM 16 horas após transfecção e Hek293 células são cultivadas por mais 56 horas. 4.) Hek293 células são colhidas e lisadas. rAAV vetores são separados de restos celulares por centrifugation. 5.) Partículas virais são purificados através de colunas de heparina antes da concentração e esterilização. 6.) Hek293 células são cultivadas em 24 placas bem e infectar com diluições seriadas do vetor AAV para determinar o número de unidades infecciosas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Figura 2. Titulação e em aplicação in vivo de rAAV1 / 2. (A) Instalação de Hek293 células para medir a título de viral. Hek293 células são transduzidas com diluições em série de rAAVs. C, o controle não infectados; N, 1 ml de ações virais não diluído. (B) Hek293 células infectadas com rAAVs expressar eGFP. (CE) expressão eGFP Viral é restrito a Cre-expressando neurônios nas regiões-alvo diferentes de camundongos transgênicos parvalbumina-Cre após a injeção estereotáxica de Cre-activated rAAVs. Imagens mostram exemplos imunorreatividade GFP em (C) pallidus do tálamo reticular e globus, (D) o giro denteado e (E) a região CA1 do hipocampo. DG, dentate giro; RT, reticular talâmico núcleo; GP, globo pálido. Barras de escala: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

vetores rAAV estão se tornando cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples e barato para produzir rAAVs, o que pode facilitar a aplicação generalizada deste vector útil, evitando a terceirização onerosa de produção de vírus para as empresas. O protocolo (com base na referência 1) descreve a produção de quimérico rAAV1 / 2 vetores contendo proteínas do capsídeo de ambos os sorotipos dos pais em proporções iguais 4. A purificação dos vetores rAAV por ligação a colunas de heparina depende da expressão de proteínas do capsídeo AAV2, mas pode ser combinado com outros sorotipos de AAV1 descritas aqui. Além disso, AAV6 tem sido relatada a ligam à heparina, embora com uma afinidade reduzida, e pode potencialmente ser purificados com colunas de heparina usando este procedimento 5,6. Deve-se notar no entanto, que outros sorotipos vai exigir diferentes concentrações de NaCl para a heparina de eluição coluna 5,7. Genomas embalagem rAAV mostrou-se ideal entre 4,1 e 4,9 kb com uma forte redução na eficiência de embalagens até 5,2 kb 8. Este limite de embalagem pode ser considerada a maior desvantagem do sistema rAAV, uma vez que células de tipo específico regulação da expressão do transgene é geralmente obtida por cis grande atuação elementos que não podem ser acomodados dentro de partículas de AAV de pequeno porte. Para superar lotes títulos baixos, tais como os resultantes da tentativa de genes pacote que estão perto do limite de embalagem AAV estamos combinando separar lotes viral concentrada a 250 mL em um lote 500 mL, ao invés de adicionar PBS, conforme descrito no passo 6.3. Transdução de células do tipo específico de confiança pode ser conseguido através da combinação de Cre-driver ratos e cassetes rAAV condicional (veja abaixo) para evitar esticar o limite de embalagem. De nota, enquanto que este protocolo tenta fornecer fácil de seguir as instruções para a produção de t de altaiter rAAV, requer a presença de AAV2 metades proteína capsidial de purificação por cromatografia de afinidade a heparina. Outros sorotipos que AAV2 deve ser purificado através de procedimentos alternativos 9. Uma vantagem de purificação coluna heparina é acredita-se para produzir vetores de AAV que têm maior taxa de infectividade do que aqueles produzidos através de um gradiente de cloreto de césio 10. No entanto, também existem algumas desvantagens para este método. Por exemplo, outras proteínas que se ligam a heparina também podem estar presentes no estoque purificada viral. Enquanto o tropismo de heparina-purificada vetores podem ser influenciados pelo título vector 10, a nossa abordagem especificamente alvo ou 20 excitatória ou inibitória neurônios (Fig. 2) emprega Cre induzida por ativação de AAV-mediada expressão do transgene e é independente do título. Uma alternativa para purificação coluna heparina é o uso de um gradiente de densidade iodixanol, que produz um título maior viral e preparação mais pura do que o uso deum gradiente de cloreto de césio 10. Este método também pode ser combinado com coluna de purificação de heparina para produzir um vetor que é superior a 99% de pureza 11. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser tomado por grupos individuais a respeito de qual método de purificação viral é melhor para sua aplicação em particular a jusante. O problema mais comum associado a este protocolo é título de viral baixa. Em nossa experiência esta pode geralmente ser atribuída a eficiência de transfecção baixo, ou a eluição dos vírus das colunas heparina. Todos os materiais de transfecção devem estar à temperatura ambiente antes de transfecção e transfections teste deve ser realizado para encontrar as condições ideais em cada laboratório. Outros métodos de transfecção, como lipofectamine, são altamente eficientes, mas pode ser proibitivamente caro. Além disso, a concentração e pH das soluções de eluição heparina coluna é fundamental para a eluição completa de virions de witho colunas heparinadanos ut. Outro ponto importante é que as células de embalagem devem aderir bem à superfície das placas de cultura de tecido. Se as células destacar em algum momento durante o procedimento é aconselhável para encerrar o experimento e descongelar um novo frasco de células. Espaço-temporal de controle de expressão do transgene em roedores é facilmente alcançado por segmentação anatômica precisa e do estágio de desenvolvimento do animal. Transferência de genes mediada por AAV eficiente tem sido mostrado no útero 12,13. No cérebro adulto, a área infectada com partículas rAAV após a injeção estereotáxica pode ser ajustado de muito pequenas regiões-alvo, para áreas muito maiores, não só por mudanças no título viral, mas também alterando os parâmetros de injeção. Estes incluem o volume ea velocidade das injeções ea inclusão do manitol poliol com a suspensão de vírus 14. Manitol pode também ser usado para melhorar a infecção de uma variedade de tecidos após a injeção sistêmica rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. A capacidade de acondicionamento de rAAV (aproximadamente 4,7 kb) é provavelmente o fator mais limitante em termos de genes que podem ser expressas a partir destes vetores virais. No entanto, estudos recentes têm mostrado que isso pode ser parcialmente superada pela divisão de genes maiores ou cassetes de expressão em vetores separados rAAV e introduzindo uma seqüência de transição, iniciando a expressão do gene, quando virions infectam a mesma célula 16. Níveis de expressão de genes realizada por vetores rAAV também pode ser bastante reforçada, usando vetores auto-cortesia rAAV 17. Injeção estereotáxica de vetores rAAV fornece um método rápido, barato e eficaz para induzir a expressão do gene de uma forma específica da região. Em combinação com 2 ª geração estratégias de interferência de RNA 18 rAAVs também podem ser usados ​​para a região específica do gene-knock down. rAAVs pode ser combinado com Cre-transgênicas ratos ou de células do tipo promotores específicos para alcançar-circuito e célula-tipoEspecíficos de expressão gênica, permitindo manipulações genéticas com alta resolução espacial 2,19-21, enquanto rAAVs montagem com o sistema tet por exemplo, a soma de controle temporal sobre vírus mediada expressão gênica 22,23. Estes exemplos ilustram o enorme potencial combinatorial desses vetores e prever um rápido aumento na rAAV baseado em estudos ao longo dos anos por vir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Amicon Ultra filtros centrífugos </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Dulbeco de Águia (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Suplemento com 10% SFB e 10 unidades / ml penicillin/100 estreptomicina mg / ml </td></tr><tr><td> Hek293 células </td><td> Americana colecção de culturas tipo </td><td> CRL-1573 </td><td> Use a passagem menos de 30 </td></tr><tr><td> HEPES solução salina tamponada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Heparina cartucho </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Meio modificado de Dulbecco Iscove </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Suplemento com FCS 5% </td></tr><tr><td> Desoxicolato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Faça solução nova para cada lote </td></tr><tr><td> 15 centímetros cultura pratos Tissue </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Solução Virkon </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Deixe para desinfectar noite antes de descartar a drenar </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos exigidos para protocolo

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

Nos últimos anos recombinante adeno-associado vetores virais (AAV) tornaram-se cada vez mais valioso para estudos in vivo em animais, e também estão sendo testadas em ensaios clínicos humanos. Tipo selvagem AAV é um membro não-patogênico da família Parvoviridae e inerentemente replicação-deficiente. O perfil de transdução ampla, baixa resposta imune, bem como a expressão do transgene forte e persistente conseguido com esses vetores tornou-os uma ferramenta popular e versátil para in vitro e in vivo a entrega do gene. rAAVs pode ser fácil e barato produzido no laboratório e, com base em seu perfil de segurança favorável, são geralmente dada uma classificação de segurança baixos. Aqui, nós descrevemos um método para a produção e titulação de rAAVs quimérico que contenham as proteínas do capsídeo de ambos AAV1 e AAV2. O uso desses vetores chamados quimérico combina os benefícios de ambos os sorotipos dos pais, tais como estoques elevados títulos (AAV1) e purificaçãopor cromatografia de afinidade (AAV2). Esses sorotipos AAV são os melhores de todos os sorotipos estudados AAV, e individualmente têm um padrão de infectividade amplo. Os vetores quimérico descritas aqui devem ter as propriedades infecciosas do AAV1 e AAV2 e pode assim ser esperado para infectar uma grande variedade de tecidos, incluindo os neurônios, músculo esquelético, pâncreas, rim, entre outros. O método descrito aqui usa purificação coluna de heparina, um método acreditado para dar uma maior título viral e mais limpo preparação viral do que os métodos de purificação, tais como centrifugação num gradiente de cloreto de césio. Além disso, descrevemos como esses vetores podem ser rápida e facilmente tituladas para dar leitura exata do número de partículas infecciosas produzidas.

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso para<em&gt; In vivo</em&gt; Estudos em animais. Descrevemos como rAAVs pode ser produzido em laboratório e como esses vetores podem ser tituladas para dar uma leitura precisa do número de partículas infecciosas produzidas.

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K visualizações.  University of Aberdeen. Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso para In vivo Estudos em animais. Descrevemos como rAAVs pode ser produzido em laboratório e como esses vetores podem ser tituladas para dar uma leitura precisa do número de partículas infecciosas produzidas.

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Produção recombinante Retroviral e infecção de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...