Agradecemos o financiamento da DARPA Micro / Nano Fluidics patrocinado Foco Fundamentos (MF3) Centro sob o número contrato N66001-10-1-4003, e da DARPA concessão N660001-09-C-2082.

1. Física do ITP ITP forma uma fronteira nítida entre os íons em movimento de carga como. A técnica pode ser realizada com amostras aniônicos e catiônicos, mas adaptamos desta introdução ao ITP aniônico e observe os mesmos princípios se aplicam a ITP catiônica. Nós escolhemos LE e TE buffers tais que os íons LE tem maior magnitude mobilidade efectiva de electroforese. O eficaz electroforética mobilidade μ, = U / E, é a constante de proporcionalidade entre campo eléctrico aplicado, E, e velocidade de deriva de iões, U. 13 Nós estabelecer uma interface entre o difusa LE e TE e aplicar um campo eléctrico dirigida a partir do alto condutividade LE zona para a baixa condutividade TE zona. O sistema rapidamente estabelece um forte gradiente de campo eléctrico na interface ITP, devido ao perfil de condutividade não uniforme. De acordo com o seu nome (do grego, &quot;isos&quot; significa &quot;igual&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocidade&quot;), TE e LE viagem íons no ve, mesmo uniformelocidade, como um resultado do campo não-uniforme eléctrico e conservação da corrente (isto é o assim chamado &quot;condição ITP&quot;, ver Figura 1). A interface de ITP é auto-afiação: iões LE que se difundem para a experiência zona TE um fluxo forte restabelecer e voltar à zona principal (e vice-versa para iões TE na zona de LE). Iões de exemplo focar a essa interface se a sua mobilidade eficaz na zona de TE é maior do que os dos TE co-iões, e se a sua mobilidade eficaz na zona de LE é menos do que a dos LE co-iões (ver Figura 1). A auto-afiação e focando propriedades do ITP contribuir para a robustez desta técnica e fazer ITP relativamente insensíveis a perturbações da interface (por exemplo, devido à pressão-driven fluxo ou mudanças na geometria, tais como contracções, expansões, e voltas). No pico modo ITP (ver Figura 2a e Vídeos 1-2), concentrações de íons de amostra sãoem todos os momentos significativamente menor do que LE e as concentrações de iões TE e, portanto, contribuir insignificante para a condutividade local. A distribuição de iões de amostra é determinada pela interface de auto-afiação entre as zonas vizinhas (aqui a TE e LE) eo valor da mobilidade eficaz da amostra em relação a estas zonas. 14 iões de amostra múltiplos concentrar no interior da região de interface estreito ITP mesma largamente sobreposição de picos. As larguras de interface e de pico, bem como o factor de pré-concentração associado, escala inversamente com a corrente aplicada (ver experiências na Figura 2b). 14 Para concentrações suficientemente elevadas amostra inicial e tempo de acumulação suficiente, os iões de amostra chegar a um valor limiar de concentração. Para totalmente ionizado espécies, este valor é determinado pela função de regulação Kohlrausch (KRF). 15 Para electrólitos fraco, é determinada pelas funções Alberty e Jovin. 16,17 Em planaltomodo, conforme representado na Figura 3 e Vídeo 3, os iões de amostra separar e purificar em zonas de concentração localmente uniforme e constante em uma ordem determinada pela sua mobilidade eficaz. Íons muito diluídas podem ainda se concentram no modo de pico entre as zonas de planalto. Em ITP, os iões de amostra pode ser introduzida em uma injecção finita entre a TE e LE (ver Figura 3) ou alternadamente misturado juntamente com o TE e / ou LE (ver Figura 2). Referimo-nos a mistura na zona de TE como &quot;semi-infinito&quot; injecção, o que pode ser usado para acumular os iões de analito continuamente. Acumulação contínua de amostras aumenta a sensibilidade em ambos os ensaios de pico e do modo de planalto. Porém, a injeção finitos são mais comuns no modo de planalto. Isto é provável porque altas concentrações de analito iniciais em semi-infinito de injeção pode aumentar substancialmente TE condutividade e menores taxas de foco. Além disso, a purificação completa não é possível em semi-infinito de injecção (uma vez que não remains concentração finito em TE). 2. Limpeza do dispositivo e preparação Para os ensaios apresentados neste protocolo usamos isotropicamente wet-gravada (secção transversal aproximadamente em forma de D) chips de vidro microfluídicos com um desenho em vários canais (ver Figura 1). A limpeza a seguir e protocolo de preparação é optimizado para os canais de sílica de borossilicato e fundida, mas também pode ser usado com vidro / PDMS fichas. Execute este procedimento de limpeza antes de experimentos para garantir a executar para rodar a repetibilidade ea aplicação bem sucedida de revestimentos dinâmicos necessários para suprimir o fluxo electro (EOF). A omissão de este protocolo pode resultar na dispersão sólida da interface ITP. 14 <ol><li> Para descontaminar o canal, preencha o Norte, Leste, Sul e reservatórios com 10-20 uL de lixívia a 10% e aplicar vácuo no reservatório Oeste por 2 min. Se estiver usando um padrão Caliper chip de caddy, vácuo pode ser efetivamente aplicada por simplesmente attaching da extremidade larga de uma uL 200 (não filtrada) pipeta para o reservatório chip e ligar a linha de vácuo para um tubo de 2 mm de diâmetro interior. </li><li> Esvaziar os reservatórios e enxaguar o canal (como no passo 1) com hidróxido de sódio 1 M durante 2 min. Este suavemente grava das paredes do canal, obtendo-se uma superfície limpa borossilicato para ajudar a estabelecer as propriedades de superfície uniforme. </li><li> Esvaziar os reservatórios e limpo, com água deionizada (DI), em seguida, lavar o canal com LE para ~ 2 min. Durante este período de propriedades de superfície e revestimentos dinâmicos equilibrar dentro do canal. </li></ol> 3. Fluoróforo com foco no pico modo ITP <ol><li> Prepare 1 mL LE consistindo em 100 mM de HCl, 200 mM de Tris, e PVP 1%. </li><li> Prepare 1 ml de TE consistindo de HEPES 100 mM e 200 mM de tris. Combinar 90 uL de TE com 10 ul de 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Após lavagem com LE, conforme descrito na Parte 2, esvazie o reservatório Oeste e limpar algumas vezes com DI ouder para diluir qualquer LE que fica no reservatório. Preencha este reservatório com 20 uL contendo TE AF488. </li><li> Coloque o eléctrodo positivo no reservatório Oriente e do solo (negativo) do eléctrodo no reservatório West e aplicar 2 uA (corrente constante). O pico da amostra irá migrar a uma velocidade constante a partir do reservatório West para o reservatório Oriente (ver Figura 1) ea tensão entre estes reservatórios irá aumentar à medida que o menor condutividade TE enche o canal. </li></ol> 4. Extracção e purificação de ácidos nucleicos a partir de E. cultivadas coli A capacidade de concentrar selectivamente espécies iónicas faz ITP uma técnica ideal para a preparação da amostra biológica. Nós purificar ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de células não tratadas, seleccionando um anião de fuga com uma magnitude de mobilidade eficaz menor do que o ácido nucleico alvo, mas maior do que os inibidores da co-iónicos de PCR (por exemplo, detergentes aniónicos, proteínas, e solventes orgânicos, mesmo presente em oiconcentração de GH). Catiónico PCR inibidores (por exemplo, metais alcalinos e de proteínas catiónicas e detergentes) migrar na direcção oposta e assim também são deixados para trás. ITP extrai e concentra-se os ácidos nucleicos alvo a partir do reservatório de amostra, deixando mais lentas PCR inibidores da espécie atrás (ver Figura 4). <ol><li> Obter uma amostra de cultura ou E. células de Escherichia para uma densidade superior a 10 8 UFC / mL. </li><li> Transferir 1 mL de cultura de células para um tubo de microcentrífuga segura-bloqueio e pelete por centrifugação a 4000g durante 6 min. </li><li> Re-suspender o sedimento em 80 de água livre de RNase uL e adicionar 10 uL de lisar agente que consiste em 10 tricina mM, 10 mM bis-tris, 2 mM de EDTA, 0,1% de Triton-X, e 5 mg / mL de lisozima. Misture suavemente e incubar por 5 minutos. à temperatura ambiente (protocolo de lise adaptado de Bercovici et al. 11). </li><li> Adicionar 10 ul de hidróxido de sódio 1 M para elevar o pH para ~ 12,5 lisado. Gentilmente acionar a pipeta para cima e para baixo atéa solução torna-se claro, em que a lise ponto está completa. </li><li> Combinar 10 uL de lisado com 90 uL de 50 mM de tricina e 100 mM de Bis-Tris. Esta solução pode agora ser usado como o TE. </li><li> Prepare 1 mL de LE consistindo de 500 mM bis-tris, 250 mM de HCl, 1% de PVP, e SYBR 1X Verde II. Encher o chip microfluídico com LE, tal como descrito na Parte 3. </li><li> A fim de extrair o ácido nucleico purificado para fora do chip análise seguindo ITP, substituir o conteúdo do reservatório Oriente, com um LE PCR compatível contendo 50mM Bis-Tris, 25 mM de HCl, e 0,1% de PVP. Aplique 1000 V entre o Oriente eo Ocidente poços para iniciar o experimento. A corrente de entre estes reservatórios irá diminuir. </li><li> No final da experiência, a amostra é eluída no reservatório LE. Coincidente com a presente eluição, o tempo versus corrente para este sistema normalmente atinge um valor patamar (uma vez que a resistência é agora dominado por iões TE distribuídos uniformemente dentro de canal). Misture delicadamente o reservatórioconteúdos por pipetagem repetida e extrair um volume de 5 uL para análise por RT-PCR quantitativo. </li></ol> 5. Separação de aminoácidos com catiónico modo planalto ITP e não-focagem traçador (NFT) para visualização ITP pode ser usado para separar e concentrar iões pequenas em planaltos adjacente e detectável entre o TE e LE. Isto permite a detecção e identificação com base nas propriedades físico-químicas, tais como a condutividade local, absorvância de UV, a detecção de temperatura, ou índice de refracção. Aqui demonstramos uma não-focagem traçador de ensaio (NFT) onde uma fluorescente, espécies co-iónico é adicionado à LE. Esta espécie fluorescente não se concentrar, mas a sua concentração se adapta a um campo eléctrico local, e, assim, permite a visualização de zonas de patamar purificadas (ver Figura 5). <ol><li> Prepare 1 mL LE consistindo em 100 mM de etanolamina, 200 mM de tricina, e 1% de PVP, e 100 mM de a 6G catiónico fluoróforo rodamina. </li> &lt;li&gt; Preparar 1 ml de TE consistindo de 20 mM de Tris, 40 mM de tricina. Preparar amostra através da mistura de 90 uL de TE com 10 uL cada uma das 50 arginina mM e 50 mM de lisina. </li><li> Dispensar 20 LE uL no Ocidente e reservatórios do Norte e amostra no reservatório Oriente. Aplicar vácuo a reservatório do Sul por 1 min. </li><li> Enxágüe bem com o Oriente DI e substituir com TE (TE sem amostra). </li><li> Aplique 500 V entre o Oriente eo Ocidente reservatórios. </li></ol> 6. Os resultados representativos Nós mostramos isotachopherograms de experiências modo de pico na Figura 2b e as experiências de extracção de ácidos nucleicos na Figura 4. Em experiências de modo pico com um repórter fluorescente (por exemplo, AF488, SYBR Green II), a intensidade global de fluorescência podem ser integrados e comparados contra uma curva de calibração para obter informações concentração quantitativa. 12 Além disso, em experiências de extracção de ácidos nucleicos, a amostra é permitido para eluir em tele LE reservatório e extraiu-se com uma pipeta, para análise por RT-PCR quantitativo. 10,12 Nós mostramos isotachopherograms modo planalto para a separação de aminoácidos na Figura 5. A intensidade da fluorescência (em relação à LE ou intensidade TE zona) pode ser usado para a identificação de zona, enquanto as larguras da zona permitir a quantificação. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (ITP) é uma técnica de eletrocinética utilizado em aplicações microfluídicos para uma detecção sensível e separação de iões. ITP oferece separação, com foco seletivo, e as capacidades de pré-concentração. Além disso, é extremamente robusto e insensível a perturbações físicas, devido à sua natureza auto-afiar. Iões de exemplo selectivamente concentrar entre um electrólito à esquerda (LE) e à direita (TE) e viajar através da microcanais a uma velocidade constante determinada pela velocidade dos iões principais na zona de LE. Íons de exemploconcentrar-se se a sua mobilidade eletroforética efetiva está entre colchetes pela mobilidade efetiva dos íons LE e TE. O esquema representa um experimento ITP modelo onde a amostra concentra-se continuamente entre o LE e zonas TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluir foco íons amostra no &quot;pico&quot; modo ITP. a) Dois distinta diluído (c amostra &lt;&lt; c LE) foco espécies no modo pico na interface formada entre o LE e zonas TE. Só o LE e TE determinar o campo elétrico, como espécie de amostra não contribuir significativamente para a atual. Iões de amostra são misturados com TE (em uma injecção semi-infinito) e se concentrar em conjunto em um pico cerca de Gaussian na interface ITP. Critério de focagem (mostrado como desigualdades) se aplica a espécies fortemente ionizado. b) Experiências mostrando Alexa Fluor 488 (AF488) concentrou-se no modo de pico para uma gama de correntes aplicadas (ver também Video 1). Largura do pico da amostra é inversamente proporcional à corrente (para a dispersão advectivo negligenciável devido ao fluxo electro-osmótico). 14 A interface do auto-afiamento é resistente à dispersão, devido à pressão orientada de fluxo (ver vídeo 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Íons Figura 3. Amostra em uma concentração suficientemente elevada foco no modo &quot;plateau&quot; e governar condutividade local. Nós normalmente introduzir íons de amostra em uma injeção finita entre a TE e LE. Nesta modalidade, os íons de amostra separada e ordem, de acordo com a sua mobilidade eletroforética eficaz (ver vídeo 3). Para as espécies fortemente ionizadas, o TE e as concentrações de planalto zona são determinadas pela função de regulação Kohlrausch (KRF, um conjunto invariante inicialmente pela zona de LE). Íons diluídos continuar a concentrar-se no modo de pico entre bracketing planalto zonas sua mobilidade eficaz. Focando criterion (mostrado como desigualdades) se aplica a espécies fortemente ionizado. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. Lisado preparação e extração de ácidos nucléicos com ITP modo de pico. O ácido nucleico é extraído a partir de E. coli cultura de células utilizando lisozima-assistida de lise alcalina e purificado por electroforese através de focagem selectiva ITP. TE misturado com lisado (marrom) contém ácido nucleico (verde), proteínas e potenciais PCR inibidores químicos. Selecção adequada de fuga e levando iões permite selectiva de focagem de ácido nucleico alvo, deixando atrás de inibidores de PCR. Total de ácido nucléico pico ITP muitas vezes assume uma forma não-ideal, como mostrado aqui na imagem ampliada. Como uma demonstração deste ensaio, foram extraídas de ácido nucleico total a partir de bactérias gram-negativas, Escherichia coli (lisadas com solução de hidróxido de sódio sozinho), purificado a partir de lisados ​​de NA utilizando ITP, recolhidosa. extraíram material genético, e realizada qRT-PCR análises para verificar a purificação de sucesso do RNAr 16S (vermelho) e 16S rDNA (verde) de cultura bacteriana Ciclos de controlo negativo limite para 16S rRNA (azul) e 16S rDNA (amarelo) eram cada acima de 30 ciclos. Foi realizada qRT-PCR usando energia SYBR Green RNA-para-C t 1 Passo-Kit da Applied Biosystems com 150 nM para a frente (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) e reverso (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primers, nas condições recomendadas ciclagem térmica. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. Non-focagem traçador de ensaio (NFT) para separação e detecção de aminoácidos não marcados. a) esquemática do ensaio NFT. Uma injecção de finito de iões de amostra é introduzida no canal Oriente. Nós misturamos o LE com um fluoróforo marcador com mobilidade catiônica efetiva menor do que os íons de TE (traçador μ &lt;μ TE). O fluoróforoDiz-se agir como um &quot;marcador underspeeding&quot;. À medida que o fluoróforo electromigrates a partir do LE em zonas agora ocupadas por planaltos amostra e TE, experimenta um campo eléctrico superior e, portanto, aumenta a sua concentração. Esta alteração na concentração cria etapas na isotachopherogram. b) Separação de dois aminoácidos, arginina e lisina, utilizando o ensaio de NFT com 6G Rodamina como o traçador underspeeding fluorescente. O pico de leve entre TE e arginina é comum em ITP, não é bem compreendido, e aqui não interfere com a detecção ou quantificação do planalto. Filme Suplementar 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> . Filme Suplementar 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> . Filme Suplementar 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Clique aqui para ver o filme suplementar</a> .

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Não temos nada a divulgar.

Os métodos aqui apresentados ITP permitir a detecção rápida, sensível e robusto e manipulação de moléculas iónicas. O principal desafio em utilizar ITP é uma escolha adequada dos buffers LE e TE. Em ITP aniónico, que tipicamente escolher cloreto como anião líder porque é um ácido forte com muito elevada mobilidade absoluta e, portanto, tem propriedades muito previsíveis. Portanto, a escolha de buffer no aniônico ITP é normalmente reduzido a escolha de um TE adequado e contra-. Para experimentos seletivos com foco, escolha TE é fundamental para a exclusão de contaminação de íons. Em aplicações onde os contaminantes não estão presentes, menor mobilidade TE eficaz conduz a taxa mais rápida de focagem. Recomendamos utilizar o seguinte, relativamente bem-comportado íons aniônicos TE: MES, MOPS, HEPES, TRICINA. Escolha de contra-afeta tanto o pH do sistema e TE mobilidade eficaz. Contraiões comuns são tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Para os ensaios que requerem pH inferior ou superior, é recomendável piridina (pKa 5,25) eetanolamina (pKa 9,5), respectivamente. Nas Tabelas 1 e 2, para ITP aniónico e catiónico, respectivamente, resumem-se vários exemplos tampão úteis. Tomamos HCl como o íon LE aniônicos e catiônicos de sódio como LE ion, e assumimos 100 mM força iónica do tampão LE. O leitor notará que a força iónica tampão nos nossos protocolos (e nas Tabelas 1-2) é sempre maior do que ou igual a 10 mM. Embora, em teoria, a física de ITP aplica-se a força iónica inferior a 10 mM, contaminantes naturais (por exemplo, ácido carbónico a partir da reacção entre água e dióxido de carbono atmosférico) perto do nível 1 mM, muitas vezes limita o uso prático de baixa força iónica buffers. Fazemos notar que o mecanismo de transdução de sinal não está limitada aos ensaios apresentados neste protocolo. Como discutido brevemente na parte 5, no modo de planalto purificado zonas podem ser detectados através de alterações na condutividade local, unidade de absorvância UVBance, temperatura, índice ou de refração. No nosso próprio grupo, desenvolvemos um método que utiliza anfólitos transportadora fluorescentes para uma detecção sensível e identificação de analitos desconhecidos. 5 Em experiências modo de pico, sondas específicas pode ser utilizada para rotular analitos focadas. Em um exemplo, nós usamos beacons moleculares - sondas de oligonucleotídeos que apresentam fluorescência em hibridação em sua seqüência alvo - para detectar DNA alvo ou moléculas de RNA com alta especificidade 11,18. Enquanto ITP é relativamente robusta para dispersão causada pela pressão do fluxo orientado e EOF, EOF excessivo pode levar a estagnação da interface ITP, onde a velocidade EOF média torna-se igual à velocidade ITP. 14 EOF Tal forte ocorre especialmente em condições de pH elevado e baixa força iônica. Por esta razão, recomenda-se o uso de tampões com pH 8 ou mais baixo e com força iónica na ordem de 100 mm, se conveniente. Em nossa experiência, é o PVPrevestimento mais eficaz para a supressão de EOF em fichas de borosilicato. No entanto, devido às suas propriedades de peneiração, PVP pode não ser adequado para algumas aplicações, tais como focagem ADN genómico. Em experiências, observa-se que a adição de PVP pode reduzir grandemente a mobilidade de DNA genómico absoluto (até ao ponto em que não se concentrar). Nestes casos um revestimento silanol tal como Sigmacote em conjunto com um agente tensioactivo (por exemplo, Triton-X 100) pode também ser eficaz na redução EOF. 10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anião (pKa -1) </td></tr><tr><td> Contra-tampão (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7,50) </td><td> tricina (8,15) </td></tr><tr><td> etanolamina (9,50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6,40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5,18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP aniónico onde o LE é 100 mM de HCl e 200 contra-ião buffer mM. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE catiônica (pKa +1) </td></tr><tr><td> Contra-tampão (pKa -1) </td><td> etanolamina (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6,40) </td><td> piridina (5,18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7,20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7,50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8,15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Magnitude de mobilidade eficaz (× 10 -9 m 2 / V / s) da zona de analito ajustada puro em ITP catiónico onde o LE é 100 mM de sódio e 200 contra-ião buffer mM.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENTES </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Água destilada </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNase / DNase livre </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> hidróxido de sódio (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> ácido clorídrico (HCl) </td><td> Merck Química </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidona (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> MW 1.000.000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 ácido carboxílico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Bélgica) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-aminoácidos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Poder SYBR Green RNA-para-C t 1 Passo-Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPAMENTO </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Chip microfluídico borosilicato </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Fornecido com ou sem plástica caddy </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> De corrente constante e constante de tensão modos de operação </td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Use lâmpada de mercúrio (Olympus) ou LED (Thorlabs) para iluminação </td></tr><tr><td> Cubo filtro </td><td> Ómega </td><td> XF115-2 </td><td> Excitação / emissão: azul / verde </td></tr><tr><td> Seguro-Lock microtubos </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml de capacidade </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Reagentes específicos e equipamentos.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Técnicas de eletrocinética são um grampo de aplicações em microescala devido à sua capacidade única de realizar uma variedade de processos fluídicos e eletroforética em simples, sistemas compactos, sem partes móveis. Isotachophoresis (ITP) é uma técnica simples e muito robusta eletrocinético que pode conseguir a separação milhão de vezes pré-concentração 1,2 e eficiente e extracção com base na mobilidade iónica. 3 Por exemplo, demonstramos a aplicação de ITP para separação e detecção sensível de não marcado moléculas iónicas (toxinas, por exemplo, ADN, rRNA, miRNA) com pouca ou nenhuma amostra preparação 4-8 e para a extracção e purificação de ácidos nucleicos a partir de matrizes complexas, incluindo cultura de células, urina e sangue. 9-12 ITP alcança de focagem e de separação utilizando um campo eléctrico aplicado e dois tampões dentro de um sistema de canal fluídica. Para analitos aniónicos, o líder de electrólito tampão (LE) é escolhido such que os seus aniões têm maior mobilidade electroforética eficaz do que os aniões do electrólito à direita (TE) tampão (mobilidade eficaz descreve a velocidade de deriva observável de um ião e leva em conta o estado de ionização da iónica, como descrito em detalhe por Persat et al . 13). Depois de estabelecer uma interface entre o TE e LE, um campo eléctrico é aplicado de tal forma que os iões LE afastar-se da região ocupada por iões TE. Íons de exemplo de raça mobilidade intermediária eficaz à frente de íons TE, mas não pode ultrapassar os íons LE, e assim eles se concentram na interface LE-TE (doravante denominado o &quot;interface ITP&quot;). Além disso, o TE e regiões de formulário LE de condutividade de baixa e alta, respectivamente, que permitem estabelecer uma gradiente de campo eléctrico íngreme na interface ITP. Este gradiente de campo pré-concentrados espécie de amostra como eles se concentram. A escolha adequada de TE e LE resulta em foco e purificação de espécies alvo a partir de outras espécies não-focadas e, eventualmente, uma separaçãosegregação d de espécies de amostra. Nós aqui rever o ITP princípios físicos subjacentes e discutir dois modos padrão de operação: &quot;pico&quot; e &quot;plateau&quot; modos. No modo de pico, relativamente diluir os íons da amostra foco em conjunto dentro de sobreposição de picos estreitos na interface ITP. No modo de planalto, os íons mais abundantes da amostra atingir uma concentração de estado estacionário e segregar em-planalto adjacentes como zonas ordenadas por sua mobilidade eficaz. Modos de pico e de platô surgir da mesma física subjacente, mas representam os regimes distintos diferenciadas pela concentração de analito inicial e / ou a quantidade de tempo disponível para a acumulação de amostra. Nós primeiro descrever em detalhe um modelo experimental modo pico e, então, demonstrar um ensaio de modo pico para a extracção de ácidos nucleicos a partir de E. de cultura de células E. coli. Nós concluímos apresentando um ensaio de modo planalto, onde usamos um não-centrados Tracer (NFT) espécies para visualizar a separação e porformar quantificação de aminoácidos.

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On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

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24.2K visualizações.  Stanford University. Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip microscopia tomográfica Empregando Multi-ângulo de iluminação e Pixel Super-resolução

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.