Este vídeo introduz um método rápido e eficiente para a síntese de nanopartículas magnéticas e o uso da magnetometria para fotografar a transformação no ambiente biológico. As nanopartículas magnéticas têm atraído maior atenção para aplicações biomédicas, e é importante entender que o destino uma vez internalizado nas células. Isso é conseguido aqui medindo o magnetismo celular.
Tanto para as nanopartículas magnéticas quanto para as medidas, o resultado pode ser afetado pela contaminação. Use frascos químicos bem limpos e certifique-se de que o equipamento magnetômetro esteja livre de contaminação. O suporte de amostras de magnetometria é geralmente usado para amostras de pó.
Mostramos como adaptar o uso do suporte a amostras líquidas ou biológicas. Em um frasco de vidro de onda de mana de 30 mililitros dissolver 400 miligramas de ferro três acetilados em 10 mililitros de álcool benzílico. Usando um reator de micro-ondas, aqueça a suspensão de 25 graus Celsius a 250 graus Celsius a uma taxa de 11,25 graus Celsius por minuto, e mantenha-a a 250 graus Celsius.
Para separar as nanopartículas, aplique um ímã de neodímio por 30 minutos. Para pellet as nanopartículas, realize uma série de lavagens usando 10 mililitros do fluido de lavagem designado e aplicando um ímã de neodímio por cinco minutos. Remova o filtrado e adicione 12 mililitros de 10 ao ácido clorídrico de menos dois molares.
Centrifugar a suspensão e um filtro de 100 kilodalton a 2.200 vezes G durante 10 minutos. Em seguida, resuspenque as nanopartículas em 10 mililitros de 10 a menos dois ácido clorídrico molar. Prepare a solução da molécula de revestimento como descrito no manuscrito.
Adicione a dispersão aquosa de nanopartículas de 10 mililitros à solução de molécula de revestimento a uma proporção de massa de cinco para um entre as moléculas de revestimento e as nanopartículas. Em seguida, agitar a mistura por duas horas em temperatura ambiente usando um agitador magnético. Após a reação completa, ajuste o pH da mistura para sete usando um hidróxido de sódio molar.
Quando a cultura das células-tronco mesenquimais humanas estiver na passagem de cinco e 90% confluentes, remova o meio e enxágue as células com RPMI livre de soro sem glutamina. A cada frasco de cultura de 150 centímetros quadrados, adicione 10 mililitros da suspensão das nanopartículas. Incubar os frascos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos.
Em seguida, descarte o meio contendo a suspensão da nanopartícula e lave as células uma vez com RPMI 1640 sem soro. Adicionar DMEM suplementado com 10% FBS e 1%de estreptomicina de penicilina. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a interiorização completa das nanopartículas.
Adicione 10 mililitros de 0,05% de trippsina EDTA pré-equipados por 37 graus Celsius a cada frasco de MSCs magneticamente rotulados. Após dois a três minutos, quando as células forem separadas, inativa imediatamente a trippsina adicionando um terço do volume de DMEM suplementado pré-avisado. Centrifugar as células isoladas a 260 vezes G durante cinco minutos.
Aspire o meio e resuspenque as células em um pequeno volume de cultura esferoide celular em uma concentração de aproximadamente 200.000 células por 50 microliters. Adicione um mililitro de cultura de esferoide celular recém-preparado a um tubo de centrífuga concítrida estéril de 15 mililitros. Em seguida, adicione um volume de suspensão celular correspondente a 200.000 células.
Centrifugar essas células magneticamente rotuladas a 180 vezes G por três minutos, a fim de formar uma pelota celular na parte inferior do tubo. Em seguida, coloque o tubo na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, mantendo a tampa ligeiramente aberta para troca de gás. Coloque um determinado volume de nanopartícula magnética ou uma suspensão fixa de esferoide de célula única no magnetômetro de amostra vibratória, ou VSM, suporte de amostra.
Se necessário, a fita PTFE pode ser usada para evitar qualquer vazamento. Insira o suporte de amostra no VSM e escaneie para deslocamento amostral. Coloque a amostra na posição correspondente ao máximo de magnetização.
Realize a primeira medição em um campo magnético baixo entre 1.500 Oersteds negativos e 1.500 Oersteds positivos a uma taxa de 20 Oersteds por segundo. Realize uma segunda medição em um campo magnético alto entre zero Oersteds e 30.000 Oersteds positivos a uma taxa de 200 Oersteds por segundo. 10 microlitres de nanopartículas dispersas em uma solução aquosa foram medidos no magnetômetro de amostra vibratória.
A inclinação da segunda parte da curva é a constante diamagnética, representando o sinal diamagnético da água e o suporte da amostra. Esta constante diamagnética foi subtraída do momento magnético da solução para obter o momento magnético das nanopartículas apenas. O momento magnético na saturação foi então determinado.
As nanopartículas revestidas foram internalizadas em células-tronco. Imagens de microscópio eletrônico mostram as nanopartículas revestidas de citrato e paa confinadas nos endossários. Depois que as células foram pelotadas por centrifugação, elas formaram um esferoide celular que pode ser mantido na cultura por longos períodos de tempo.
Esferoides células individuais também foram medidos usando o VSM e o momento magnético de saturação foi usado para calcular a quantidade de nanopartículas em uma amostra celular. A absorção das nanopartículas dependeu da concentração de incubação. Uma diminuição no magnetismo dos esferoides celulares ao longo do tempo indicou a biodegradação das nanopartículas, o que foi confirmado pela microscopia eletrônica.
A degradação foi mais substancial nas nanopartículas revestidas de citrato do que nas nanopartículas revestidas de PAA. Usando magnetometria, a degradação das nanopartículas magnéticas dentro das células pode ser precisamente quantificada, e o impacto do futuro das nanopartículas sobre o interessado no comportamento bruto pode ser avaliado. Neste protocolo, as medidas de magnetometria foram realizadas em esferoides celulares, mas podem ser estendidas às células em suspensão ou em órgãos.
Com o método descrito, você é capaz de explorar as interações de nanopartículas magnéticas recém-projetadas em diferentes sistemas celulares de interesse, mas também você pode seguir sua biodistribução in vivo e destino.
