A simulação dinâmica molecular é uma técnica computacional que pode ser usada para explorar movimentos moleculares e pode revelar mudanças conformais cruciais para entender a função bioquímica e celular. Sondar a gama de movimentos dinâmicos acessíveis a uma macromolécula é difícil. O uso dos resultados de simulações dinâmicas moleculares em conjunto com dados experimentais permite a avaliação de sua significância funcional.
Demonstraremos usando simulações dinâmicas moleculares como as mutações observadas em pacientes com câncer afetam as confirmações de alvo do EGFR e a ligação de ligantes. Para preparar o APO ativo do tipo selvagem EGFR, nossa estrutura de quinase, abra o programa de visualização kymera e, no menu de arquivos, clique em buscar pelo ID.Selecione o banco de dados protein e especifique o código Protein Data Bank 2GS2. Para construir os elementos estruturais ausentes 2GS2, adquira esses segmentos a partir de outras estruturas EGFR.
Para construir o glutamato de cinco resíduos 746 para a exclusão de Alanine 750 ELREA em EGFR, clique favorito, sequência e mostre sequência para abrir a sequência wild-type 2GS2. E na janela de sequência resultante, clique em editar e adicionar sequência para selecionar a sequência de formato FASTA mutante de exclusão. Na janela de alinhamento, selecione a estrutura e o modelo ou a írmologia.
Na janela pop-up, especifique a estrutura composta 2GS2 como o modelo e a sequência mutante como a consulta a ser modelada, em seguida, selecione um modelo mutante dos modelos resultantes com base na pontuação zDOPE e inspeção visual. Para preparar a estrutura de quinase apo inativa do tipo selvagem EGFR, abra a estrutura do Protein Data Bank 2GS7 e adicione os segmentos ausentes das outras estruturas EGFR, modelando a forma mutante de exclusão como demonstrado. Para preparar a estrutura de quinase ativa EGFR, vinculada à ATP, use a estrutura do Protein Data Bank 2ITX como estrutura principal, construindo os segmentos ausentes usando outras estruturas EGFR e modelando a forma mutante de exclusão usando o modelador como demonstrado.
Para construir a estrutura assimétrica de dimer EGFR do tipo selvagem, abra 2GS2 em Kymera e ferramentas de clique, estrutura de ordem superior e célula unitária para converter a estrutura para o conjunto biológico que contém as quinases ativadora e receptora no arranjo assimétrico. Selecione a estrutura 2GS2 e digite fazer cópias, em seguida, selecione e salve um único dimer assimétrico das múltiplas cópias do dimer resultantes das operações de simetria. Para construir o mutante de valina alanina 702, selecione ferramentas, edição de estruturas e rotadores para substituir alanina 702 por valina.
Abra as estruturas no Maestro e clique no botão do assistente de preparação de proteínas, em seguida, selecione adicionar átomos de hidrogênio e preencher átomos de cadeia lateral ausentes e clique em pré-processo. Para determinar os estados de protonação de resíduos ionizáveis no pH 7.0, clique em refinar e usar PROPKA para otimizar a orientação de resíduos de asparagina, glutamina e histamina para ligação de hidrogênio, então minimize a estrutura. Para configurar o sistema de simulação, abra o programa LEAP e importe o campo de força Amber FF14SB e as moléculas de água TIP3P.
Para os sistemas vinculados à ATP, importe parâmetros para ATP e carregue a estrutura. Solvate a estrutura em uma caixa octaédral com moléculas explícitas de água TIP3P que se estende 10 angstroms em todas as direções a partir dos átomos superficiais da proteína. Verifique o sistema de correia e adicione os íons necessários para neutralizá-lo.
Para modelar suficientemente sistemas biomoleculares, adicione átomos adicionais de sódio e cloreto à caixa de simulação para levar a concentração de sal do sistema a 0,15 molar, depois gerar e salvar a topologia e coordenar arquivos do sistema para servir como entradas para a simulação de produção subsequente. Usando o Amber, inicialmente a energia minimiza o sistema de simulação para contornar quaisquer configurações desfavoráveis. No arquivo de entrada de minimização, ajuste a variável de ciclo máximo para o ciclo de minimização total e o número de ciclos para indicar o número de ciclos para o algoritmo de descida mais íngreme.
Use a variável de peso de contenção para aplicar a força de contenção nos átomos solutos especificados pelo parâmetro da máscara de contenção. Realizar a minimização em múltiplas etapas, gradualmente reduzindo a contenção aplicada nos átomos solutos de 25 para 0 quilocalorias por quadrado de angstrom mole, em seguida, use o comando para executar a minimização. Aqueça o sistema por 100 picosegundos de 0 a 300 Kelvin e use os comandos para definir um molar de 10 quilocalorie por angstrom quadrado em átomos solutos.
Em seguida, use o comando para realizar o aquecimento. Equilibre o sistema para 900 picosegundos sob um conjunto isotémico isotémico e defina um corte de nove angstrom de distância para interações eletrostáticas de longo alcance, gradualmente reduza a contenção do átomo soluto para 0,1 quilocalorie por quadrado de angstrom mole e finalize o equilíbrio com uma simulação de cinco nanossegundos sem restrições. Execute a equalização com o comando conforme indicado.
Ajuste o texto para permitir que a simulação de produção seja realizada por 100 nanossegundos com as conformações sendo salvas a cada 10 picosegundos e, em seguida, execute a simulação com o comando conforme indicado. Para visualizar a amostra de conformação durante as simulações de quinase EGFR do tipo selvagem e mutante, abra os arquivos de topologia âmbar e os arquivos de trajetória correspondentes na Visual Molecular Dynamics. E utilizando representações convenientes de estrutura secundária, analise a dinâmica estrutural geral das proteínas a partir da trajetória registrada.
Em seguida, veja interações específicas entre átomos e resíduos de interesse, como a catalisticamente essencial 745-glutamato 762 ponte salgada. Alternativamente, salve várias conformações amostradas durante a simulação no formato do Protein Data Bank e abra as conformações em Kymera. Use a opção casamenteira para sobrepor as estruturas na estrutura inicial ou mediana e exibir a estrutura mediana em sólido e o resto das estruturas alinhadas em branco desbotado para permitir a visualização dos movimentos estruturais registrados com mais clareza.
Analisar a estabilidade global dos EGFRs do tipo selvagem e mutante e examinar a flexibilidade das diferentes unidades estruturais, importe a tipologia âmbar e os arquivos de trajetória correspondentes. No arquivo de entrada de desvio quadrado médio da raiz, indique os átomos de espinha dorsal da estrutura inicial como referência para o ajuste quadrado médio da raiz. No arquivo de entrada de flutuação quadrada média da raiz, indique os átomos C-alfa da estrutura inicial como referência para o ajuste quadrado médio da raiz.
Em seguida, execute a análise com o programa CPPTRAJ e plote os dados de saída. Alternativamente, para alinhar os conjuntos conformais e colorir cada resíduo com base na raiz do átomo C-alfa, abra as conformações em Kymera e alinhe-as com a opção casamenteira. Selecione ferramentas, representação e renderização por atributo.
Selecione resíduos dos conjuntos conformais e defina a raiz C-alfa significando desvio quadrado como os atributos e, em seguida, clique em OK. O traço de corrente das conformações será colorido azul, branco ou vermelho refletindo as regiões de alta, média e baixa estabilidade estrutural, respectivamente. Para analisar as interações de ligação de hidrogênio entre ATP e EGFRs de tipo selvagem e exclusão, prepare um script CPPTRAJ para realizar essa tarefa. Especifique a análise das ligações intermoleculares de hidrogênio apenas com a variável nointramol e defina uma ligação de hidrogênio com um doador que aceita menos ou igual a 3,5 angstroms e um ângulo de ligação maior ou igual a 135 graus.
Para avaliar as interações intramoleculares, por exemplo, entre os resíduos de lise e glutamato catalíticos importantes, especifique a lise como doador de hidrogênio e o glutamato como os resíduos aceitos e execute o script conforme indicado para permitir a análise do resultado. Para calcular as energias livres de ligação entre ATP e EGFRs de tipo selvagem e exclusão, prepare os arquivos do receptor de ligante e do complexo de ligantes Protein Data Bank no programa LEAP e coloque o ATP como o ligante e o EGFR como receptor. Defina o valor generalizado de rádio nascido para M Bond I2. Em seguida, gere a topologia Amber e coordene arquivos para os arquivos do Banco de Dados de Proteína da fase gasosa.
Da mesma forma, para calcular as energias livres de ligação entre o ativador e as quinases receptoras de EGFRs de tipo selvagem e alanina 702 valine, especifique a quinase receptora como o ligante e o ativador quinase como receptor e salve a topologia correspondente e os arquivos de coordenação. Prepare um arquivo de entrada de área de superfície nascida generalizada e defina o valor IGB para dois e o saltcon para 0,1. Em seguida, usando a mmpbsa.
py script disponível em Âmbar, digite o comando como indicado para executar os cálculos de energia de vinculação e analisar os dados de saída. Durante esta simulação representativa de 100 nanossegundos, o mutante de valina alanina 702 mostrou maior estabilidade conformacional do segmento de justxtamembrano B provavelmente devido a interações hidrofóbicas mais apertadas em comparação com o EGFR tipo selvagem. O mutante de valina alanina 702 também apresentou uma menor energia livre de ligação entre o ativador e as quinases receptoras em relação ao EGFR tipo selvagem, representando interações mais favoráveis de dimer que mantêm a conformação ativa da quinase EGFR.
A simulação da mutação de exclusão resultou em flutuações menores do átomo C-alfa da hélice alfa C-hélice alfa de tecla funcional em comparação com o EGFR do tipo selvagem, prolongando o tempo do estado ativo EGFR. A mutação de exclusão também resultou na formação frequente de ligações de hidrogênio entre os átomos polares da cadeia lateral de 745 e glutamato 762, uma interação chave para a atividade enzimática EGFR em comparação com o EGFR tipo selvagem. Além disso, o número de ligações de hidrogênio entre ATP e EGFR foram maiores para o mutante de exclusão do que para o EGFR do tipo selvagem.
A mutação de exclusão também resultou em um movimento interno do estado inativo alfa C-hélice, uma mudança estrutural esperada durante a transição para o estado ativo. Em contraste, o alfa C-hélice do EGFR inativo do tipo selvagem manteve sua conformação inicial. Para avaliar o impacto das mutações, é fundamental selecionar os estados conformais apropriados das estruturas e preparar e equilibrar adequadamente essas estruturas.
É importante combinar simulações dinâmicas moleculares com estudos experimentais, pois a sinergia entre essas técnicas beneficia a interpretação dos resultados e pode informar experimentos adicionais de laboratório molhado.
